体外诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的实验研究

目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与血管平滑肌细胞直接接触培养后向血管成分细胞的分化及超微结构改变.方法 将MSCs(DAPI标记)与血管平滑肌细胞按一定的比例混合培养后,用平滑肌细胞抗体SM-α-actin、calponin免疫荧光染色,并用透射电镜观察MSCs的超微结构改变,检测MSCs的分化情况.结果 MSCs与血管平滑肌细胞混合培养5d后免疫荧光染色,可见胞核蓝染的MSCs与抗SM-α-actin、抗calponin (绿色)的双标细胞出现;而单独培养的MSCs抗SM-α-actin阳性,抗calponin为阴性.并且混合培养后的MSCs电镜下可见肌丝状结构.结论 血管平滑肌细胞直接接触可以诱导MSCs向血管平滑肌细胞分化.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及凋亡的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经细胞诱导分化的潜能,及分化后的凋亡情况?方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基对第三代MSCs进行诱导分化,诱导分化的细胞按分化时间3?7?14 d分成A?B?C三组?三组诱导分化细胞分别进行NSE免疫组织化学,MAP2免疫荧光化学以及TUNEL凋亡细胞检测?结果:A?B?C三组细胞在细胞形态上与神经细胞相似,并且表达神经细胞特异性标记抗原NSE?MAP2,但是C组细胞表达强度弱于B组,并且阳性细胞比例少于B组(P < 0.05)?A?B?C三组TUNEL凋亡阳性细胞比例呈逐渐增多趋势(P < 0.05)?结论:含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,随着诱导时间的推移,分化细胞状态下降,凋亡比例增多?     

体外诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)主要存在于骨髓中,在脐血、外周血、脂肪、皮肤等多种组织中也相继分离出MSCs。MSCs具有多向分化的能力,在一定条件下可分化为各种不同来源的细胞。目前,MSCs的分离培养、诱导分化及鉴定体系已趋成熟,其在临床应用的前景广阔。血管内皮细胞(VECs)来源于中胚层,因此MSCs具有分化为VECs的可能性。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞

目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞的可行性。方法：直接抽取成年健康志愿者骨髓，采用直接贴壁法培养获得较纯的人骨髓间充质干细胞；用免疫组织化学方法进行表面标志的检测、鉴定及培养扩增后，以HaCaT细胞培养上清液联合表皮生长因子（EGF）诱导分化，透射电镜下观察细胞形态的变化；并运用免疫组织化学方法检测K10，K19及β1整合素的表达。结果：诱导BMSCs1周后可见大量扁平的多角形细胞紧密连接成片，呈铺路石状排列生长，胞浆内可见丰富的角蛋白丝；大量细胞K19和β1整合素双染阳性，个别细胞K10染色阳性。结论：BMSCs在HaCaT细胞培养上清液联合EGF的体外培养条件下可诱导分化为表皮干细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为雪旺样细胞的方法

目的 :建立人骨髓间充质干细胞体外向雪旺样细胞定向诱导分化的方法。方法 :取健康人骨髓血标本 ,利用percoll(密度为 1.0 73 g·ml-1)分离骨髓单个核细胞 ,在DMEM LG + 10 % (体积分数 )FBS中培养 ,通过流式细胞术对培养细胞进行表型测定 ,对第 2、3、5、8代间充质干细胞进行定向诱导分化 ,用单抗S 10 0、神经胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillargacidicprotein ,GFAP) ,通过免疫组化方法对诱导的细胞进行鉴定。 结果 :经 percoll分离的间充质干细胞可传 16代 ,细胞数增加了大约 6× 10 7倍。流式细胞术结果显示 :percoll分离出来的未经培养的细胞 ,其CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 3 2 .4 7%± 3 .4 9% ,而培养后贴壁细胞中CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 94 .3 8%± 1.5 0 %。诱导后免疫组化染色结果显示 :由 β ME +bFGF预诱导、β ME +bFGF诱导的S 10 0阳性细胞最多 ,可达 90 %± 4 % ,GFAP阳性细胞为 2 1%± 5 %。结论 :人骨髓中间充质干细胞能定向诱导分化成雪旺样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的：研究大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)离体分离和培养方法,诱导MSCs向神经细胞样细胞分化。方法：通过梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞,进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化MSCs,对其生长特性进行分析。分别用硫代甘油和β-巯基乙醇对MSCs诱导分化,观察细胞形态变化,免疫组化检测分化细胞中nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,进行鉴定。结果：用含15％胎牛血清(FCS)的L—DMEM培养MSCs,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,生长特征呈“S”形,有较强的增殖能力,于第10代以后开始出现衰老征象。MSCs经硫代甘油和巯基乙醇诱导分化后,细胞形态发生改变,nsetin,NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论：大鼠MSCs可以离体分离,培养,并能诱导向神经细胞样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞体外扩增和向心肌细胞分化的实验研究

①目的 探讨兔骨髓间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向心肌细胞诱导分化的条件。②方法 取兔股骨骨髓。利用密度为1．073s／mL的Percoll分离骨髓细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增骨髓间质干细胞。取第二代和第三代的骨髓间质干细胞，以含有不同浓度的5-氮杂胞苷诱导培养基向心肌细胞诱导分化。③结果 诱导后的细胞呈现典型的心肌细胞样改变，免疫组化染色显示其α-横纹肌动蛋白阳性。④结论骨髓间质干细胞在体外具有向心肌细胞分化的潜能。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的方法。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代细胞培养48h，分为4组：A组加入心肌组织块条件培养液、B组加10μmol／L 5-氮胞苷（5-aza）、C组为二者的混分液、D组不加任何诱导剂以作对照组。应用免疫细胞化学方法检测各组心肌特异性蛋白α-actin的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示，A组细胞培养3周时可检测到α-actin阳性细胞，阳性细胞较多；B组培养1周可见弱阳性细胞，随时间延长，阳性着色增强且阳性细胞数增多，3周时呈强阳性表达；C组2周即可检测到细胞呈强阳性着色。对照组MSCs胞浆内未检测到α-actin的表达。4个组的阳性细胞率进行两两比较均有统计学意义（P〈0.05）。结论心肌组织块条件培养液和5-aza联合应用可促进MSCs体外分化为心肌样细胞。     

软骨细胞与骨髓间充质干细胞隔离共培养构建组织工程化软骨

目的探讨隔离共培养条件下,软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化并形成软骨组织的能力。方法分别提取并培养兔BMSCs和耳软骨细胞,以5．0×10^7／ml的终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架上并置于Transwell室内。实验组Transwell下方为贴壁软骨细胞,对照组Transwell下方为DMEM培养液（含10％胎牛血清）。两组BMSCs-支架复合物体外培养8周后植入裸鼠皮下,继续培养6周后取材。通过大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生组织进行评价。结果体外培养期间,实验组和对照组BMSCs在支架上黏附良好并能分泌细胞外基质,RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖有较强的表达,而对照组两者的表达较低或检测不到。裸鼠皮下培养6周,实验组BMSCs-支架复合物能基本保持原形,组织学染色及免疫组织染色显示新生组织有明显的软骨陷窝形成并表达软骨特异性细胞外基质。对照组BMSCs-支架复合物逐渐皱缩变形,未见形成软骨样组织。结论采用Transwell隔离共培养的方法,软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的实验研究

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSC),并诱导其向神经元细胞分化.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养,并通过诱导培养基进行体外诱导培养,比较对照组及实验组间细胞形态和神经丝蛋白(NFP)表达率的不同.结果:诱导后,实验组中80%的细胞表现出神经元样形态,且NFP阳性表达率明显高于对照组.结论:MSC在体外可以被诱导为神经元样细胞.     

诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外诱导成软骨细胞的生物学特性，为骨组织工程提供实验依据。方法体外培养获取生长状态良好的兔骨髓间充质干细胞，进行成软骨诱导，观察并检测其生物学特性。结果BMSCs在转化生长因子-β1、维生素C的作用下，7d后可见细胞多变为圆形或椭圆形，并聚集形成软骨样结节，阿利辛蓝染色、蕃红花“O”-亮绿染色显示细胞内酸性粘多糖含量高，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，PCR检测有Ⅱ型胶原的表达，表现出软骨细胞的分化特点。结论在特定诱导条件下，兔BMSCs体外可定向诱导分化为软骨细胞，为骨组织工程提供实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的：实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。     

骨髓间充质干细胞对急性淋巴细胞白血病小鼠骨髓移植后GVHD和GVL的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)和移植物抗白血病(GVL)的影响。方法:以ALL小鼠为动物模型,对其进行al-lo-BMT的同时,静脉输注经体外培养的供鼠BMMSC,同时设立单纯allo-BMT对照组。流式细胞仪检测受鼠CD4+、CD8+T细胞亚群的差异;记录受鼠存活时间;观察受鼠发生GVHD一般反应及病理学变化。结果:BMMSC减少受鼠CD4+T细胞数量的同时增加CD8+T细胞的数量;明显延长ALL小鼠allo-BMT后的生存时间;推迟GVHD发生的时间。结论:BMMSC与allo-BMT联合移植具有一定的GVL;BMMSC能抑制ALL小鼠allo-BMT后GVHD的发生,但同时具有一定程度的GVL。     

复合bFGF的磷酸钙骨水泥对小鼠骨髓间质干细胞体外生长的影响

目的：观察复合bFGF的磷酸钙骨水泥对小鼠骨髓间质干细胞体外生长的影响。方法：分离、纯化及传代培养小鼠骨髓间质干细胞，检测复合bFGF的磷酸钙骨水泥对骨髓间质干细胞集落产率和骨髓间质干细胞增殖分数的影响。结果：单纯CPC对骨髓间质干间细胞增殖有抑制作用，复合bFGF的CPC不仅可抵消了单纯CPC对骨髓间质干间细胞增殖的抑制作用，还能促进其增殖，所形成的集落数为空白对照组的106．7％，增殖分数达1．092。结论：复合bFGF的CPC对骨髓间质干细胞的增殖有促进作用。     

骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是一群均一的细胞，具有自身的增殖特征及组织化学特征．它在适宜的微环境中能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和星状神经细胞等，它易于分离、扩增，易于外源基因导入表达，有望成为细胞治疗和基因治疗的新型靶细胞，具有广阔的应用前景。     

人骨髓间充质干细胞体外培养方法探讨

目的：建立并优化人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分离、消化、传代扩增等培养方法．方法：以Percoil(1．073g／mL)、Ficoll(1．077g／mE)和A液(笔者配制)3种分离介质分离MSCs．传代时以不同浓度胰蛋白酶对MSCs进行消化．结果：A液对MSCs的分离效果最佳，不同蛋白酶液对MSCs消化能力不同。结论：建立了一套稳定、低耗、有效的MSCs培养方法。     

体外诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导条件下分化为心肌细胞的特征。方法:小鼠胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上增殖培养,先将ESCs悬浮培养形成23d的拟胚体(EBs),再将23dEBs种植到含有TGFβ1的24孔板中进行诱导,以及种植到铺有END2细胞饲养层的24孔板中进行诱导,培养液中同时加入TGFβ1。免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(αActin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。流式细胞仪检测EBs集落心肌细胞的平均分化率。结果:TGFβ1诱导组和TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导组分别有43%,91%(P<0.05)的拟胚体出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白αActin和TnT,以及观察到心肌样超微结构,但在共培养的条件下,自发节律性收缩区域较大,且细胞形态较单一。两诱导组EBs集落心肌细胞平均分化率分别是35%,74%(P<0.05)。结论:TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养对小鼠ESCs向心肌细胞定向分化有协同作用,具有较高的诱导分化率。     

骨髓间质干细胞多向分化及其机制的研究进展

骨髓间质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能。而关于其分化机制,目前认为是微环境因素诱导,通过一定的信号转导通路传递,转录因子抑制或激活,启动关键基因表达的结果,本文综述了骨髓间质干细胞的生物学特征、多向分化及分化机制的研究进展。     

体内心肌微环境诱导骨髓干细胞分化的研究

目的：了解干细胞动员剂动员的骨髓干细胞的心肌细胞分化潜能及对缺血心肌的影响。方法：采用异丙肾上腺素(ISO)皮下注射制作大鼠心肌梗死模型，联用粒细胞集落刺激因子(DCSF)和低分子量硫酸葡聚糖动员大鼠自体骨髓干细胞释放和迁移至心肌梗死灶，于用ISO后24、48h、2周杀死大鼠，取出心脏，通过免疫组化、苏木精-伊红染色和Van Gieson‘s苦味酸性复红染色方法观察大鼠心肌梗死灶的CD34^ 细胞的浸润及心肌再生、心肌纤维化的情况。结果：用ISO后24h，动员组大鼠心肌梗死区可见CD34^ 细胞浸润，并有CD34^ 新生心肌细胞生长；2周后瘢痕组织少，心肌纤维化程度轻，缺血心肌基本结构得到保护。结论：急性心肌梗死发生后，联用G-CSF和低分子量硫酸葡聚糖能迅速动员自体骨髓干细胞向心肌梗死灶内迁移、存活和向心肌细胞、血管内皮细胞等分化．并能抑制缺血心肌纤维化和保护缺血心肌基本结构。     

人骨髓间充质干细胞的培养及细胞增殖测定

目的 分离培养并鉴定人骨髓间充质干细胞.方法 成人骨髓取自非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性的胸外科手术中摘取的肋骨,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原.结果 人骨髓间充质干细胞(MSCs)的CD44表达阳性;早、中、晚3代传代培养具有以下共性特征:传代培养潜伏期约为24～36 h;传代培养对数增殖期约为4～6 d;对数增殖期结束后至接种后第9 d,MSCs生长逐渐缓慢,进入平台期.结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞.