肝细胞的低温保存及应用研究进展

随着生物人工肝和肝细胞移植研究的开展 ,对肝细胞的需求不断增加 ,迫切需要有效的肝细胞长期保存方法以促进其在临床上的应用。低温保存是目前保存肝细胞的重要方法 ,其影响因素较多 ,主要有低温保存肝细胞的形式冻存液的组成、降温、复温速度 ,复苏肝细胞的功能检测及应用范围等。本文对国内外该方面的最新进展进行综述     

大鼠肝细胞的玻璃化保存

玻璃化方法保存生物材料是近年来低温生物医学领域较为热门的话题,应用这种方法可以使生物材料在保存过程中免于冰晶效应和溶液效应的损伤,提高存活率。目前认为用玻璃化方法保存生物材料是最理想的深低温保存方法。本实验选用大鼠肝细胞作为样品,进行玻璃化保存的尝试,旨在验证玻璃化保存肝细胞的可行性,并提供一种肝细胞的保存方法。     

海藻糖对生物人工肝用人永生化肝细胞系C3A细胞低温的保存

背景：随着生物人工肝在临床上的应用,需要有一种方便、有效、实用的保护生物反应器装载细胞活力及功能的方法,设计有自主知识产权的生物人工肝用肝细胞的低温保护液迫在眉梢。 目的：验证海藻糖作为低温保护剂在4 ℃低温保存肝细胞的作用。 方法：采用C3A人永生化肝细胞系在不同低温保存液(DMEM培养液,乳酸钠林格氏液,加有不同浓度海藻糖的乳酸钠林格氏液,UW液)4 ℃保存24,48,72 h。复苏后行细胞活力、细胞损伤指标、氧自由基代谢相关指标等检测,并通过荧光双染法观察细胞凋亡情况。 结果与结论：不同低温保存液保存不同时间C3A细胞的活力、细胞损伤及细胞凋亡表现均有所不同,其中同时间点不同浓度海藻糖组均优于单用乳酸钠林格氏液组,但不如UW液组(P < 0.01)。而保存24 h的不同浓度海藻糖组及UW液组与乳酸钠林格氏液组相比差异无显著性意义(P > 0.05),提示海藻糖能有效减轻低温对肝细胞凋亡及缺血再灌注损伤的程度,可成为低温保存液中有效及重要的保护剂组分。     

钙离子超载对低温保存人肝细胞的损伤作用

目的　研究分离培养的成人肝细胞在低温保存状态下 (0～ 4℃ )的钙离子代谢特点和钙离子超载的损伤作用机理。方法　成人肝脏细胞分离和培养 ,用钙离子荧光探针检测保存液的钙离子浓度。结果　低温保存下 ,细胞内游离钙离子迅速升高 ,逐渐达到稳态水平 ,随细胞内钙离子的升高 ,细胞的存活率也逐渐下降 ,但在含0 .5 m MCa Cl2 的保存液组 ,保存效果明显好于其它两组 ;在含 1.5 m MCa Cl2 的保存液组 ,继发的钙离子超载峰值出现早而且要高于原发的钙超载峰。结论　低温保存可以引起成人肝细胞的钙超载 ,细胞外钙是细胞钙超载的主要来源 ,继发超载是缺血再灌注损伤的主要原因     

微囊化细胞的低温保存

背景：微胶囊是一种有效的免疫隔离工具,低温冷冻方便了微囊的保存与运输,有利于微囊化技术在临床的推广应用。 目的：综述微囊低温保存技术中微囊低温保存特点、不同保存方法优缺点、研究方法及微囊低温保存实验现状。 方法：检索1980/2010 PubMed数据库,1991/2010万方数据库、维普数据库有关微囊低温保存研究,低温保存工艺理论及专用仪器,微囊低温保存技术医学应用的文献。 结果与结论：微囊化细胞在低温保存过程中的损伤特点与细胞、组织有很大不同。微囊相对较大的尺寸与复杂的囊壁半透膜结构,使得微囊结构与囊内细胞更容易受到溶质损伤与冰晶损伤,因此不能简单套用单细胞悬液的低温保存方案。慢速冷却法与玻璃化法是两种常见的微囊化细胞低温保存方法,各有利弊。微囊化细胞低温保存技术尚未成熟,在开发新型微囊低温保存设备,优化设计微囊低温保存方案的同时,需进一步加强对微囊冻存机制更深层次的探索。     

自制多脏器保存液对大鼠睾丸一氧化氮合酶的影响

背景：在睾丸移植过程中,低温保存和缺血可导致睾丸产生氧自由基而损伤睾丸组织。 目的：观察自制多脏器保存液对低温保存大鼠睾丸一氧化氮合酶的影响。 方法：采用自制多脏器保存液和UW液低温保存大鼠睾丸,分别于保存24,48,72 h时切取睾丸,测定睾丸组织内的总抗氧化能力和一氧化氮合酶活性。 结果与结论：自制多器官保存液低温保存各时点大鼠睾丸一氧化氮合酶活性和总抗氧化能力与UW液组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。表明自制多脏器保存液能明显减轻低温保存大鼠睾丸氧自由基损伤,其作用与经典的美国威斯康星大学UW保存液基本相当。     

移植供体的保存

<正>低温保存移植物方法已经得到了广泛应用,如保存哺乳动物的细胞,包括血液细胞、动物胚胎和人的胚胎等,保存异体移植物皮瓣、肌腱、角膜等。而用于器官移植的低温保存技术与普通的保存方法不同,其技术的关键还有降温迅速,待升温后器官仍能恢复活性,采用低温而不是冷     

组织工程化肌腱种子细胞深低温保存的实验研究

对肌腱种子细胞进行深低温保存，研究保存过程中多个环节的影响因索对细胞存活率的影响及深低温保存对种子细胞生物学特性、胶原分泌功能的影响。实验结果表明二甲基亚砜是肌腱种子细胞深低温保存中比较好的抗冻保护剂；冻存后使用与培养时不同的营养血清处理对细胞有损害，可降低细胞存活率；在冷冻保存过程中，细胞存活率与细胞浓度有一定关系，浓度太低可能降低细胞存活率；细胞在冷冻保存时，降温速度对细胞存活率有影响，慢速的分步降温组细胞存活率明显高于直接人液氮的快速降温组；采用10％二甲基亚砜加15%小牛血清加75% DMEM配方保存肌腱种子细胞，对其分泌胶原功能无明显影响，对其生长曲线、细胞周期及染色体众数无明显改变，适于肌腱种子细胞的保存。     

肝细胞复合体的低温保存实验研究

探索微载体cytodex3与细胞结合的复合体低温保存的可行性。以cytodex3为支架体系,细胞类型采用贴壁细胞肝细胞,观察低温保存对细胞复合体的影响,包括低温保存对微载体Cytodex3支架性能的影响,以及复合体复温后细胞与微载体的黏附存活率、细胞功能指标的代谢情况。实验结果表明,肝细胞复合体低温保存2周后,微载体上的细胞活性与单独细胞冻存相比无显著差异,能够正常生存并保持增殖和产物分泌能力。细胞与载体黏附培养细胞密度大,细胞生物活性高,低温保存复苏后肝细胞功能良好,可用于构建生物人工肝。     

自制移植肝低温保存液对氧自由基的影响

背景：在肝脏移植过程中,低温保存和缺血可导致肝脏产生氧自由基而损伤肝组织。 目的：研究自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏氧自由基的影响,并与器官保存液的“金标准”UW液进行对比。 方法：16只9周龄SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组8只。建立SD大鼠肝脏灌注模型,分别用自制器官保存液组和UW液组灌洗肝脏,取出肝脏置于4 ℃保存液中,于保存24,48,72 h后分别检测肝脏超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力和活性丙二醛水平。 结果与结论：自制器官保存液对大鼠肝脏低温保存各时点超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力活性及丙二醛含量与UW液组比较差异均无显著性意义(P > 0.05),表明自制器官保存液能够减轻缺血再灌注后氧自由基对大鼠肝脏的损伤。自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏在减轻氧自由基损伤方面有较好的效果,与UW液相当。     

血细胞的深低温保存与临床应用

本对血细胞深低保存的机制作一概述,介绍了近年来各血液成分的深低温保存技术、效果和临床应用。     

微流体技术在低温保存领域的研究进展

微流体技术可能是解决低温保存过程中所遇到问题的一种有效方法。本文详细综述了微流体技术在细胞膜渗透性、保护剂添加与去除、生物材料玻璃化保存三方面的研究进展,总结了在低温保存领域应用微流体技术仍可能存在的问题,并指出了未来的研究方向。     

丹参素干预体外低温保存大鼠肝脏血红素氧合酶1的表达

背景:研究发现丹参能够降低诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达,减少一氧化氮的产生,抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素等炎性因子的分泌,具有抗氧化作用。丹参素作为丹参的重要单体成分,是否具有相同的作用?目的:验证丹参素干预大鼠肝脏血红素氧合酶1的表达,以及对体外肝脏低温保存肝脏的保护。方法:建立大鼠肝脏低温灌注保存模型。分为3组,对照组术前腹腔注射生理盐水,术中用乳酸林格液灌注;实验组术前腹腔注射生理盐水,术中用丹参素+乳酸林格液灌注;抑制剂组:术前腹腔注射锌原朴啉,术中用丹参素+乳酸林格液灌注。保存0,1,3,6h,分别RT-PCR检测血红素氧合酶1mRNA及蛋白表达的情况,检测细胞线粒体钙离子含量及钙离子ATP酶活性,电镜观察各组肝细胞、线粒体形态改变,光镜观察肝细胞、肝小叶形态改变。结果与结论:实验组肝血红素氧合酶1mRNA及蛋白的表达水平明显比其他两组高(P0.05)。实验组的肝细胞线粒体钙离子含量明显较其他两组低,Ca2+-ATP酶活性较其他两组高。结果提示,丹参素灌注保存液可以诱导大鼠肝脏中血红素氧合酶1的过表达,延长肝脏低温保存时间。     

人体标本保存液改良研究的现状及展望

<正>在医学解剖学、病理学、以及考古学等多个领域,人体标本发挥着重要的作用,因此完好地保存人体标本的重要性不言而喻。目前,国内外用于保存人体标本的方法有很多种,包括低温保存、液体保存、脱水保存等。其中液体保存最易推广,使用最为广泛。人体标本的保存液配方有上百种,甲醛是应用最广泛     

低温保存对生物样本及其生物大分子的影响

生物样本库在现代医学研究中的作用日趋重要,基于生物样本库的研究成果层出不穷,极大地推动转化医学的发展。生物样本库中样本保存的质量对研究结果的可靠性有较大影响,如何保存高质量的样本是生物样本库研究的关键问题之一。低温保存技术可以保持样本的活性,若将其用于生物样本库,不仅能够保存样本完整的分子信息,还能保持样本的活性,对生物样本库的发展具有里程碑式的意义。综述低温保存方法对样本的损伤(尤其是生物大分子的损伤)以及减小这些损伤的技术与方法,为提高生物样本的保存质量提供指导性建议。     

胶体对大鼠肝脏低温保存及移植后微循环保护作用的研究

灌洗保存液中肢体渗透压的维持被认为是器官保存的必要条件之一。本研究应用大鼠原位肝移植模型采用生化检测、共焦激光扫描显微镜技术研究发现，保存液中加入羟乙基淀粉（HghroxyethylStarchHES）或低分子石旋糖酐Dex40能够有效地防止肝脏低温保存的肝血窦内皮细胞损伤，同时能改善移植后再灌注肝脏的微循环障碍，进而保护移植肝功能、DeX40的作用优于HES。结论：保存液中加入胶体成分，对防止肝脏的缺血再灌注损伤是有益的，可能与其能有效地维持胶体渗透压有关。Dex40可成功地替代HES作为维持胶体渗透压的有效成分。     

酸性成纤维细胞生长因子复方保存液对大鼠肝脏低温保存的作用

目的: 探讨人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对离体大鼠肝脏低温保存的效果。方法: 24只Wistar大鼠随机分为高渗枸橼酸盐腺嘌呤(HCA)液对照组和aFGF复方保存液(HCA液中含aFGF_14-154 40 μg/L)实验组,分别用HCA液和aFGF复方保存液进行肝脏离体灌注,并低温保存肝脏。12和24 h后,测定肝脏保存前后的重量、肝组织丙二醛(MDA)含量及肝保存液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性的变化,并检查肝组织病理学改变。结果: 离体肝脏低温保存24 h后,aFGF复方保存液组肝脏重量差、ALT、AST和MDA水平均明显低于HCA对照组 (P<0.05);肝脏病理学检查结果显示,aFGF复方保存液组肝组织损伤明显减轻。结论: aFGF复方保存液对肝脏的低温保存效果较单纯HCA液更明显,其机制可能与aFGF参与抑制细胞肿胀和抗氧化损伤作用有关。     

自制GPC-Ⅱ-3液对兔肝低温延时保存的形态学观察

目的 探索对供肝具有较长时间保护作用的器官保存液。方法 20只新西兰大白兔(体重2．5～3．0kg)随机分为实验组(15只)和实验对照组(5只)。用自制的器官保存液(GPC-Ⅱ-3液)，低温冷藏连续保存兔肝0～192h，观察其组织结构的变化。结果 保存0～120h的兔肝，其组织结构基本正常；保存到144h兔肝，电镜下见肝细胞的线粒体出现轻度肿胀和嵴少：随着保存时间的延长肝细胞出现明显的细胞变性。结论 用GPC-Ⅱ-3液以低温冷藏的方法能够在组织结构上保存兔肝120h。     

生殖细胞的细胞膜渗透特性研究进展

生殖细胞的低温保存在多个领域具有重要应用价值。为提高保存后细胞的存活率与活性,研究细胞膜对水和低温保护剂的渗透特性十分必要。本文综述了近年来动物生殖细胞的细胞膜渗透特性研究概况,列出了典型的精子细胞和卵母细胞的细胞膜对水和常见低温保护剂的渗透系数,分析了这些细胞的渗透特性对制定其低温保存方案的影响。论文还介绍了细胞膜渗透特性的最新测量方法。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景：获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。 目的：比较用UW液在4 ℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。 方法：贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4 ℃低温保存0,24,48及72 h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。 结果与结论：随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P < 0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48 h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P  > 0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P  < 0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P  < 0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P  < 0.01)。结果提示,UW液4 ℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48 h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。