在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的可行性.方法抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后,应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记技术进行细胞标记.将已标记的细胞以注射方式回植到提供骨髓的猪的皮内及皮下,分别于注射后1、2、4周取材,常规石蜡包埋,行BrdU和角蛋白免疫荧光双染色,激光共聚焦显微镜观察.结果大多数BrdU阳性细胞聚集在真皮中的小血管周围.但有少数BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层,并同时表达角蛋白.结论在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表皮细胞的潜能.     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

不同诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元分化的影响

目的 寻找一种较为理想的诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元的诱导剂及方法.方法 采用人淋巴细胞分离液从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增后,以不同组合的复合神经诱导剂加以诱导,诱导期间观察细胞形态的变化,通过免疫细胞化学鉴定诱导细胞的分化情况,并用SPSS 12.0进行数据分析.结果 人骨髓间充质干细胞在加入不同组合的复合神经诱导剂后,均出现了胞体收缩、突起伸出的神经元样改变.免疫组化结果显示,兔抗人巢蛋白(nestin)、鼠抗人神经丝单克隆抗体(neurofilament,NF)出现了不同的阳性率,其中以E组阳性率最高,nestin(5.653±1.228)%,NF(74.724±3.651)%,兔抗人胶质纤维酸性蛋白(gliafiber acid protein,GFAP)免疫组化染色均呈阴性,SPSS 12.0分析显示各诱导组之间差异具有显著性意义(P＜0.05).结论 本实验探索出一种较为理想的诱导入骨髓间充质干细胞分化为神经元的复合神经诱导剂及方法.     

三磷酸胞苷二钠诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨三磷酸胞苷二钠体外诱导大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的条件.方法:从大鼠双侧股骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有三磷酸胞苷二钠(MSCs)的培养液对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定.结果:CTP浓度为0.2 mg/ml时,能够诱导NF、GFAP 和 NSE 阳性细胞比例为(32.73±0.63)%、(62.77±2.45)%、(30.41±0.65)%,显著高于对照组(P<0.01).结论:MSCs可通过体外培养并纯化,CTP可以诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化,最佳诱导浓度为0.2mg/ml.     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。     

骨髓间充质干细胞联合定向诱导的神经元样细胞移植治疗脊髓损伤

[目的]探讨一定条件下骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的能力,并进一步研究两种细胞联合移植治疗脊髓损伤(spinalcord injury,SCI)的效果。[方法]选取3个月龄雌性SD大鼠62只,2只处死后提取骨髓间充质干细胞用于细胞培养和分化研究,剩余大鼠采用改良Allen’s法制备T9～11SCI模型,然后随机分为4组(n=15),A组为空白对照组,B组为干细胞组,C组为神经元样细胞组,D组为联合移植组。诱导后的细胞采用免疫荧光方法检测细胞表面特异性标志,各组细胞用Hoechst33342标记,脊髓损伤模型建立1周后将细胞以局部注射的方法移植到损伤区,细胞移植后的1、2、4、6周对各组动物进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分,并行HE染色、荧光显微镜、免疫荧光法检测细胞在体内的存活和分化。[结果]术后2、4、6周各细胞移植组BBB评分较空白对照组相比显著增加(P0.05),D组高于B、C两组(P0.05),B、C两组组间比较差异无统计学意义(P0.05)。HE染色示B、C、D组术后6周的脊髓空洞较A组均减小,以D组最明显;荧光显微镜显示移植的细胞存活于脊髓损伤的区域;免疫荧光染色显示诱导后的细胞与体内存活的细胞表面特异性标志神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、神经丝蛋白200(neuroflament200,NF-200)表达呈阳性,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达呈弱阳性,其中D组NSE和NF-200阳性细胞数量较多,B、C两组较少。[结论]体内体外一定条件下骨髓间充质干细胞都有向神经元样细胞分化的能力;骨髓间充质干细胞和定向诱导的神经元样细胞都可用于移植治疗脊髓损伤,但以两者联合移植治疗的效果最佳。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的研究体外三维培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化软骨细胞可行性。方法用密度梯度离心法分离纯化BMSCs,并传代扩增后,用离心三维培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养,以常规培养液培养的BMSCs作为阴性对照,于诱导培养第21天取出标本行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、s-100蛋白免疫组织化学检测。结果BMSCs经21d的离心三维诱导培养后,培养管出现软骨外观组织块,组织切片甲苯胺蓝染色呈明显异染,s-100蛋白免疫细胞化学检测阳性。对照组阴性。结论成人BMSCs在三维培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。     

人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的研究进展

一般认为，成熟的心肌细胞是终末分化细胞，缺乏再生能力。有研究表明，少数成体心肌细胞在终末分化之后还具有分裂能力，但由于数量极少，不能达到修复损伤心肌的目的。因此，心肌损伤后只能由成纤维细胞增生形成瘢痕而修复，但只有增加心肌细胞或心肌样细胞的数量才能改善此类病人的心功能。目前，心血管外科临床应用的心血管修复材料都缺乏收缩性和生长潜能，并有钙化和血栓生成的危险。寻找理想的心血管材料一直是先心外科基础研究的热点之一，心肌组织工程则提供了一种全新的思路和治疗策略。理想的种子细胞是能否获得工程化功能心肌的要素之一。近年来，利用骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）进行细胞移植或作为种子细胞的研究广泛开展，     

脂肪间充质干细胞成神经元诱导分化研究进展

增加具有完整功能的种子细胞数目及提高其定向分化能力一直是组织工程研究的重要课题。脂肪间充质干细胞(ADSC)诸多优点在成体干细胞研究中备受青睐,有望成为组织工程种子细胞的新成员。该文就神经组织工程中ADSC生物学特性、获取与培养、成神经元分化能力及其与生物支架的相容性等方面的研究进展,作一综述。     

体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力.方法 利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增3代,倒置显微镜观察细胞生长及形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达.取扩增第3代的BMSCs,分为2组,诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、2μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的M199培养基]中诱导分化,对照组则不加任何细胞因子.2周后行细胞形态学观察,免疫细胞化学法检测VEGF受体(VEGFR)-2表达,流式细胞仪测定CD34表达量,紫外线分光光度法测定一氧化碳(NO)含量,电镜观测胞质WeibelPalade小体.结果 STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型.流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原:CD44和CD90阳性细胞表达率分别为(97.8±0.9)％和(96.8±1.4)％,而CD11 b/c和CD34阳性细胞表达率分别为(13.2±0.6)％和(1.2±0.5)％.诱导组大部分细胞形态变化不明显,呈长梭形、杆状、多角形,诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为(97.1±1.0)％和(65.0±3.9)％,而对照组则为(7.0±1.0)％和(0.9±0.3)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);诱导组胞外NO含量(94.14±3.25) μmol/L亦明显高于对照组(70.37±2.10) μmol/L(P ＜0.05);电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体.结论 经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs.糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化,BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞.     

Isolation, characterisation and osteogenic potential of human bone marrow stromal cells derived from the medullary cavity of the femur

Marrow stromal cells (MSC) are increasingly being introduced in orthopaedic practice as potentially powerful effectors of bone regeneration. Since cell recovery of MSC is affected by a high degree of individual variability, sources for collecting adequate amounts of safe and effective MSC under routine conditions are needed. We analysed if femoral bone marrow, which is usually discarded during total hip arthroplasty procedures, is a reliable source of MSC to enhance bone healing and regeneration. Mononuclear cells were isolated, assayed for typical MSC markers, harvested under appropriate culture conditions and evaluated for their ability to differentiate into osteoblasts. Cell recovery and osteogenic potential were independent from donor gender or age, suggesting that elderly individuals are eligible for autologous cell therapy. Although heterogeneous, the pool of MSC recoveredfrom femoral marrow without further in vitro selection or manipulation proved highly effective in proliferating and differentiating along the osteogenic lineage. In conclusion, this source of MSC offers a valuable tool to be used to promote osteogenesis and implant fixation.     

人脱细胞骨复合骨髓基质细胞成骨活性的实验研究

目的 研究人脱细胞骨(HAB)复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测。方法 用15％的过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养。通过碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行复合培养。8d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。结果 人髂骨块内细胞清除干净,骨基质保存良好;诱导后的骨髓基质细胞ALP和OCN水平明显高于对照组(P<0.05);复合后的人脱细胞骨培养液中ALP和OCN检测呈阳性;骨髓基质细胞在HAB支架内附着紧密,生长良好。结论 人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料。     

人骨髓基质干细胞体外诱导培养的新方法研究

目的为骨组织工程的临床应用提供一种新的人骨髓基质干细胞(BMSCs)培养方法,以满足细胞培养过程中对各类细胞因子的需求,同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入。方法采用10%富血小板血浆(PRP)替代动物血清配比高糖DMEM培养基,体外诱导培养(50μg/mL抗坏血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)人BMSCs,快速扩增后,倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及细胞增殖情况。ALP染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果人BMSCs24h开始贴壁,7d左右细胞融合。诱导培养后细胞能较快地扩增;ALP染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。结论以自体PRP替代动物血清体外诱导培养人BMSCs是一种良好的培养方法,所培养的细胞数量及其生物学特性能快速达到临床应用的需求。     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。     

骨髓基质细胞移植于缺血心肌的研究

国家自然科学基金资助项目 ( 30 170 935)目的　研究骨髓基质细胞移植于缺血心肌后的分化增殖情况和对心功能的保护作用。方法　以同基因背景的Lewis大鼠为研究对象 ,将溴氮胞苷 (BrdU)标记的骨髓基质细胞移植于结扎冠状动脉的大鼠缺血心肌内 ,4周后观察移植细胞的分化增殖情况和促血管生长作用 ,并用超声检测心功能改变。结果　细胞移植 4周后 ,可以在缺血心肌内找到BrdU标记的移植细胞 ,其中相当一部分细胞已分化为肌浆球蛋白重链 (MHC)阳性的心肌细胞。另外IIIV因子染色可见实验组移植区内有大量的血管新生 (2 3± 4/HPF) ,而对照组中却很少发现 (2± 1 /HPF) ,差异有非常显著性 (P <0 .0 1 )。超声检查显示移植骨髓基质细胞后可显著改善缺血心脏功能 ,其中实验组动物射血分数 (EF)升高了 0 .2 51± 0 .1 0 3 ,而对照组却降低了 0 .0 94± 0 .0 0 3 ,差异有非常显著性 (P<0 .0 1 )。结论　骨髓基质细胞移植于缺血心肌后可以向心肌细胞转化 ,并可明显改善心肌功能     

成骨诱导的兔骨髓基质干细胞成骨活性的表达及维持

目的观察成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)体内、外环境下成骨活性的表达及维持。方法观察BMSCs在体外成骨诱导培养条件下的成骨分化特性;构建兔BMSCs与活骨组织共培养模型模拟体内“成骨环境”,将成骨诱导的MSCs置于共培养及普通传代培养条件下进行传代培养,观察经成骨诱导的BMSCs在体外及模拟体内的培养条件下细胞的表型维持情况。结果药物成骨诱导培养的BMSCs,其ALP活性及骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.05);经过诱导培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性。RT-PCR法半定量测定Ⅰ型胶原mRNA,成骨诱导培养的Ⅰ型胶原mRNA表达量明显高于普通传代培养对照组。药物成骨诱导后的细胞在体外普通传代培养传5代后,细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平及Ⅰ型胶原表达稳定维持在较高水平,保持其成骨细胞的表型;在共培养条件下,ALP活性、骨钙素水平Ⅰ型胶原表达保持在高水平,且ALP活性、骨钙素水平在大部分时间点均高于普通传代培养。结论药物成骨诱导培养呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点,能使ALP、骨钙素及Ⅰ型胶原表达短期内达到高水平;经成骨诱导的BMSCs在体外或模拟的体内传代培养条件下,均能维持成骨表型,保持成骨活力。     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用

目的：观察成骨生长肽诱导体外培养的大鼠骨髓基质细胞增殖及向成骨分化的作用。方法：取6周龄SD大鼠，贴壁法分离培养骨髓基质细胞，在不同浓度成骨生长肽的诱导下，观察细胞形态变化，绘制骨髓基质细胞生长曲线，碱性磷酸酶和钙结节组织化学染色。结果：成骨生长肽对骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用呈剂量依赖性：成骨生长肽浓度在10^-10及10^-11mol／L时促进骨髓基质细胞增殖，而在10^-8及10^-9mol／L时对骨髓基质细胞的增殖略有抑制作用；成骨生长肽浓度在10^-10及10^-11mol／L时骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色基本呈阴性，与对照组相比差异无统计学意义，而在10^-8及10^-9mol／L浓度下可以显著提高骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色的阳性率。结论：成骨生长肽可以明显促进大鼠骨髓基质细胞增殖及向成骨细胞分化，其促成骨活性具有显著的浓度依赖性。     

骨髓基质细胞促进引导性骨再生的研究

目的观察骨髓基质细胞增强引导性骨再生（GBR）修复骨缺损的能力。方法30只兔造成双桡骨干15mm骨缺损，以硅胶管桥接骨断端，实验组在硅胶管内注射自体骨髓基质细胞（MSC）1ml；对照组注射等量生理盐水。在不同时间内作X线片、大体、组织学观察及生化捡测。结果实验组成骨活跃，10周骨缺损完全修复，对照组各时间点骨修复均较实验组差，10周时仍无1只兔骨性愈合。术后4周实验组钙及碱性磷酸酶含量明显高于对照组（P〈0．01），术后8及10周实验组骨缺损区新生骨骨痂密度与相邻尺骨密度比值亦明显高于对照组（P〈0．01）。结论自体骨髓基质细胞可明显增强GBR修复骨缺损的能力。     

骨髓基质干细胞及其在骨组织工程中的应用

骨髓基质干细胞（BMSCs）是一群存在于骨髓中的非造血干细胞,具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞等多种细胞.BMSCs的应用是目前国际上骨组织工程领域的重要研究内容,具有广泛的临床应用前景.近年来,许多实验室从分子、生化、物理等水平对其成骨分化调控进行了深入研究,取得了较大的进展.