Cox7a2荧光载体构建及其在小鼠睾丸Leydig细胞表达和定位研究

目的构建Cox7a2的荧光表达载体,研究其在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达和定位。方法原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达。利用BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点把Cox7a2克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-Cox7a2定位。结果Cox7a2表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。绿色荧光的YFP-Cox7a2和红色荧光的线粒体标记物- Mitotracker有完全的共定位。结论Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建Cox7a2真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-Cox7a2定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞合成功能障碍的研究提供重要的信息。     

Cox7a2在TM3睾丸Leydig细胞中表达,定位及与ERK1/2磷酸化相关性研究

目的:研究Cox7a2的荧光表达载体在TM3睾丸Leydig细胞中的表达和定位及对ERK1/2磷酸化的影响。方法:将Cox7a2克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜观察其在TM3细胞中的表达和定位,Westernblot检测ERK1/2磷酸化水平。结果:在TM3细胞中,绿色荧光YFP-Cox7a2和红色荧光线粒体标记物-Mitotracker有完全的共定位,过量表达YFP-Cox7a2能引起ERK1/2磷酸化水平增高。结论:成功表达了YFP-Cox7a2融合蛋白,确认了其在TM3细胞的线粒体定位。YFP-Cox7a2过表达和ERK1/2磷酸化水平有联系,为探讨Cox7a2对TM3细胞睾酮分泌及其相关信号传导通路的影响奠定了基础。     

Cox7a2通过ROS调控睾丸Leydig细胞睾酮生成的研究

目的 研究Cox7a2调控睾酮牛成的影响及其机制.方法 构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞.ELISA法测定上清液中睾酮含量,Western blot检测类固醇合成快速调节蛋白StAR表达,荧光分光光度计检测ROS水平.结果 Cox7a2抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,升高ROS水平.结论 Cox7a2通过抑制类固醇合成快速调节蛋白StAR的表达调控睾酮分泌,至少和增高ROS水平有关.     

Cox7a2对睾酮合成及StAR、P450scc和3β-HSD蛋白表达影响研究

目的研究Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leyidg细胞中过农达对LH诱导的睾酮合成及对StAR(睾酮合成调节关键蛋白),P450scc(胆同醇侧链裂解酶),3β—HSD(3β-羟基甾脱氢酶)蛋白表达的影响。方法构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞,融合蛋白表达及LH诱导刺激后,ELISA测定细胞上清液中睾酮含量,Western blot检测StAR蛋白、P450scc和3β-HSD酶的表达变化。结果Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中过表达抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,对P450scc和3β-HSD的蛋白表达没有明显影响。结论在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,Cox7a2至少通过抑制类固醇快速调节蛋白StAR的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。     

Cox2 蛋白在胃癌及淋巴结转移中的表达及意义

目的：探讨环氧合酶2 (Cox2) 蛋白在远癌胃组织、胃癌原发灶及胃癌淋巴结转移病灶的表达情况及意义。
方法：采用免疫组织化学的方法测定60例原位灶胃癌标本、相应的60例远癌胃组织标本及其中36例胃癌淋巴结转移灶的石蜡标本的Cox2 蛋白表达情况。比较Cox2 蛋白在上述各组中的表达情况。
结果：与远癌胃黏膜表达比较,Cox2蛋白在胃癌原发灶中表达均明显上调（P=0.000）;淋巴结转移病灶中的Cox2蛋白明显高于原位病灶（P=0.03）。
结论：Cox2蛋白高表达参与了胃癌的发病过程,并可能促进了胃癌的淋巴结转移。     

自噬信号因子P70S6K参与Cox7a2调控睾酮生成机制研究

目的:研究Cox7a2对TM3 Leydig细胞睾酮生成的影响以及涉及其中的自噬调控信号的作用。方法:构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3 Leydig细胞。ELISA测定睾酮水平,Western印迹检测Cox7a2对睾酮合成快速调节蛋白StAR表达和自噬调控因子P70S6K磷酸化水平的影响。结果:在TM3 Leydig细胞中,LH刺激能增加促进StAR蛋白表达,增加睾酮合成水平。Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中抑制P70S6K磷酸化水平,降低StAR蛋白的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。结论:Cox7a2通过抑制快速调节蛋白StAR的表达减少LH诱导的睾酮分泌,这至少和Cox7a2抑制自噬调控因子P70S6K有关。     

小鼠睾丸组织Bmi1基因的克隆及原核表达

目的:克隆小鼠Bm i1 cDNA并进行原核表达,为下一步制备BM I1多克隆抗体奠定基础。方法:从小鼠睾丸组织中克隆Bm i1 cDNA,测序并利用BLAST程序比对证明该基因序列正确后,构建原核表达载体pET-28 c-Bm i1,将其转入大肠埃希菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过免疫印迹检测重组目的蛋白。结果:成功克隆了小鼠Bm i1 cDNA,原核表达的融合蛋白可与H is标签抗体和BM I1单克隆抗体特异性结合。结论:小鼠睾丸组织中Bm i1基因有表达;成功克隆了小鼠Bm i1 cDNA并在大肠埃希菌BL21中正确表达了重组蛋白rBM I1。     

国人瘦素基因原核重组表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定瘦素基因原核重组表达载体.方法 以RT-PER法自人脂肪组织制备目的 基因,应用DNA重组技术,克隆至pMD18T载体与pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌DH5α,EcoR I+Xho I双酶切及测序鉴定.结果 扩增得到520 bp目的 基因并构建原核重组表达载体pGEX-4T-1-leptin.双酶切电泳见520bp目的 条带,测序结果与GenBank收录序列一致.结论 成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-leptin,为leptin功能研究及进一步的临床应用提供了条件.     

B7-1、B7-2联合应用治疗小鼠肝癌的研究

我们应用含小鼠B7—1、B7—2基因片段的真核表达载体PCI—neo-B7—1和PCI—neo-B7—2分别转染H22肝癌细胞。探讨B7—1、B7—2在肿瘤免疫过程中的不同功能与作用。     

Cox7a2和ATP50在原代培养小鼠Leydig细胞和人体不同器官的表达研究

目的 研究线粒体呼吸链相关基因Cox7a2,ATP50在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞和人体各器官组织中的表达特征.方法 原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并鉴定,利用RT-PCR方法 研究Cox7a2,ATP50在Leydig细胞中的表达.利用PCR方法 研究Leydig在人体各重要脏器组织的表达谱.结果 Cox7a2,ATP50在原代小鼠睾丸Leydig细胞中表达,Cox7a2和ATP50在各个脏器旱现出不同的表达特征.结论 Cox7a2,ATP50表达在原代小鼠睾丸Leydig细胞中,研究Cox7a2,ATP50在人体各器官的表达特点,为基因的功能研究奠定了前期基础.     

Cox7a2荧光载体构建及其对小鼠支持细胞细胞色素C氧化酶活性的影响

目的 构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,研究其在小鼠睾丸支持细胞(TM4)中的表达及对细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响.方法 应用RT-PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点将Cox7a2克隆到pEYFP-C1载体,经酶切、测序及蛋白印迹等技术进行鉴定,并将重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2转染TM4细胞后6、12、24、48 h,采用分光光度计测定COX活性.结果从TM4细胞克隆到Cox7a2基因完整的编码序列,大小为252 bp.构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,转染TM4细胞的效率达70%,融合蛋白表达产物相对分子质量为37 000.重组质粒转染后6、12、24、48 h时COX活性分别为(0.642±0.051)、(0.542±0.049)、(0.311±0.021)和(0.216±0.010)U/mg,不转染组和转染空载体组分别为(0.714±0.064)、(0.653±0.031)U/mg.与不转染组相比,重组质粒转染后12、24、48 h组COX活性显著降低(P＜0.05).结论重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2 载体成功构建.Cox7a2基因对TM4细胞COX活性具有抑制作用,可能对调控COX活性发挥重要作用.

Abstract：

Objective To construct Cox7a2 fluorescent vector and study its effect on cytochrome C oxidase (COX) activity in mouse Sertoli cell line TM4. Methods The coding region of Cox7a2 was amplified from mouse Sertoli cell line TM4 by RT-PCR. The PCR product was inserted into pEYFP-C1 vector with BamH I and EcoR I restriction site, and confirmed by DNA sequencing. The recombinant fusion protein vector was amplified by transforming into DH5a and transfected into TM4 cells. The protein expression was identified by Western blot. COX activity was measured by spectrophotometer 6, 12, 24 and 48 h after the transfection of recombinant vector into the TM4 cell line. Results The entire coding sequence of Cox7a2 was cloned with 252 bp length. Plasmid pEYFP-C1-Cox7a2 vector was constructed and the positive clones were verified by restriction enzymes digestion and DNA sequencing. The transfection efficiency of the TM4 cell line was about 70% and 37000 D fusion protein was obtained. The COX activities were (0.642±0.051), (0.542±0.049), (0.311±0.021) and (0.216±0.010) U/mg 6, 12, 24 and 48 h after the transfection of recombinant vector in the TM4 cell line. Meanwhile, the COX activities were (0.714±0.064) and (0.653±0.031) U/mg in non-tranfected and naked vector group respectively. Compared with the non-tranfected group, COX activity decreased significantly 12, 24 and 48 h after the transfection. Conclusions The recombint plasmid vector was successfully constructed. Cox7a2 gene has an inhibiting effect on COX activity and may play an important role in the regulation of COX activity in mouse Sertoli cell line TM4.     

胸苷激酶1和B7-H4在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的 观察胸苷激酶1(TK1)和B7-H4在乳腺癌组织中的表达,探讨两者与乳腺癌临床病理特征的关系.方法 收集64例乳腺癌患者手术切除的癌组织和癌旁组织标本,应用免疫组织化学法检测以上组织石蜡切片中TK1和B7-H4的表达水平.结果 TK1在乳腺癌组织中表达率明显高于癌旁组织(84.38％比15.63％,P＜0.01),B7-H4在乳腺癌组织中表达率明显高于癌旁组织(75.00％比20.31％,P＜0.01);TK1表达水平与乳腺癌乳腺癌肿瘤大小、组织学分化程度、TNM分期和淋巴结转移明显相关(P＜0.05),B7-H4表达水平与乳腺癌组织学分化程度和TNM分期明显相关(P＜0.05).结论 乳腺癌组织中TK1和B7-H4呈高表达,提示两者在乳腺癌的发生发展中有重要意义.     

B7-H1 与B7-H4 在膀胱癌大鼠及其癌旁组织中的差异表达

目的:研究膀胱原位癌组织及癌旁组织中共刺激分子 B7-H1与 B7-H4的表达情况,并分析二者的相关性。方法:采用 N-亚硝基 -N-甲基脲(MNU)溶液膀胱灌注法制备膀胱癌大鼠模型(30只),处死大鼠,获取癌组织及癌旁组织,进行病理检查;采用生理盐水溶液膀胱灌注法作为对照组( 12只),处死大鼠,获取膀胱组织,进行病理学检查;采用 RT-PCR技术分别检测对照组大鼠膀胱组织( A组)、膀胱癌模型组癌组织( B组)及模型组癌旁组织( C组)中 B7-H1与 B7-H4的 mRNA的表达水平,并分析二者之间的相关性。结果: 30只膀胱癌模型组大鼠, 28只模型制备成功,造模成功率 93.3%。A组、C组 B7-H1、B7-H4 mRNA表达量均明显低于 B组(0.71±0.38、0.79±0.21 vs 1.44±0.67;0.84±0.22、     

SDF-1、CXCR4及ERK1／2在病理性瘢痕中的表达及临床意义

目的：检测病理性瘢痕组织中SDF-1,CXCR4及ERK1／2的表达并探讨其在病理性瘢痕中的相互作用机制。方法：采用免疫组织化学SABC法检测66例病理性瘢痕,25例非病理性瘢痕及27例正常皮肤中SDF-1,CXCR4及ERK1／2的表达。结果：与正常皮肤及非病理性瘢痕相比,SDF-1、CXCR4及ERK1／2三者在病理性瘢痕中均高表达（P〈0．05）;在病理性瘢痕中,SDF—1与ERK1／2的表达呈正相关关系（r=0．293,P〈0．05）,CXCR4和ERK1／2的表达呈正相关关系（r=0．284,P〈O．05）结论：SDF-1／CXCR4生物轴在病理性瘢痕形成过程中可能通过调节ERK1／2途径从而在病理性瘢痕的增生中发挥重要作用。     

转化生长因子β1及其信号转导分子Smad4,Smad7在人脑胶质瘤中的表达及其意义

目的　探讨转化生长因子 β1及其超家族肽类的细胞内转导分子Smad4和Smad7在人脑胶质瘤中的表达及其意义。方法　采用免疫组织化学方法 ,对经过石蜡包埋的 3 0例胶质瘤和8例正常脑组织标本进行定位和定性检测。结果　TGF β1,Smad4和Smad7蛋白在胶质瘤中均有不同程度的表达 ,Smad4的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增高而降低 ,且在正常脑组织、低、高级别胶质瘤组中的表达差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;TGF β1,Smad7在正常脑组织中几乎不表达 ,在低级别胶质瘤 (Ⅰ Ⅱ级 )中表达较少 ,在高级别胶质瘤 (Ⅲ Ⅳ级 )中表达较多 ,两者在正常脑组织及高、低级别胶质瘤中的表达两两比较差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。且TGF β1与Smad7的表达水平呈正相关 (r =0 .78,P <0 .0 1) ;TGF β1与Smad4的表达水平呈负相关(r =-0 .67,P <0 .0 1)。结论　TGF β1,Smad7蛋白的阳性表达与组织学分级密切相关 ,它们参与了在人脑胶质瘤细胞的恶性转化 ,而Smad4对胶质瘤的进展有抑制作用。