乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

小鼠巨噬细胞转染Rv0901基因后活性的改变

目的 将重组结核分枝杆菌Rv0901基因的重组质粒pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠腹腔巨噬细胞,研究结核分枝杆菌Rv0901基因在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中所起的作用.方法 制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rv0901质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA混合,以脂质体转染的方式共转染小鼠腹腔巨噬细胞.转染后72 h,分别收集细胞用流式细胞仪检测GFP的表达和细胞凋亡的发生情况,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测质粒的转染情况.收集转染72 h后的细胞培养液上清,检测细胞NO、IFN-γ的释放水平.结果 pcDNA3.1和pcDNA3.1-Rv0901转染的巨噬细胞中均检测到了GFP的表达,转染后的巨噬细胞RT-PCR能扩增出Rv0901的目的 片段,pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞的凋亡率高于空载体对照组[(56.4±2.0)% vs (19.9±1.5)%,P＜0.05], pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞培养液上清中NO和IFN-γ的释放量高于空载体对照组[NO:(40.4±3.0) μmol/L vs (27.5±3.2) μmol/L, IFN-γ:(2.11±0.031) ng/mL vs (0.62±0.025) ng/mL,P均＜0.05].结论 pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠巨噬细胞后使巨噬细胞的凋亡增加,NO和IFN-γ的释放量增加,提示结核分枝杆菌Rv0901基因可能导致巨噬细胞的活性增强,与结核分枝杆菌感染巨噬细胞的机理有关.     

hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其机制.方法 分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1转染SKOV3/DDP细胞.RT-PCR和Western blot检测hMLH1的表达.MTT检测转染前后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化.经顺铂DDP作用后,流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,瞬时转染24 h后,SKOV3/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05).MTT结果显示,转染细胞的IC50值(13.95±2.45)较未转染的细胞(94.16±5.18)明显减小.流式细胞仪和Western blot检测结果表明,顺铂作用24 h后,转染了重组质粒的耐药细胞的凋亡率提高到(33.33±2 31)%,同时凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达受到抑制(1.35±0.39),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 hMLH1基因能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低该耐药细胞内Bcl-2的表达水平,促进细胞凋亡有关.     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

bcl-2基因转染对人胃上皮细胞GES-1增殖的影响

目的:观察bcl-2基因脂质体法转染人胃上皮细胞系GES-1及其转染后对GES-1细胞增殖的影响. 方法:以脂质体法转染构成bcl-2基因表达的人胃上皮细胞系GES-1细胞模型,空载体质粒pcDNA3转染GES-1细胞及正常GES-1细胞为对照;经酶标免疫组织化学法鉴定bcl-2基因表达阳性细胞;用HE染色法进行形态学观察;并采用细胞计数及MTT法分析bcl-2转染后对GES-1细胞增殖的影响. 结果:脂质体法转染bcl-2基因后,细胞高表达Bcl-2蛋白;HE染色后形态学观察无明显改变;细胞计数法绘制细胞生长曲线结果显示bcl-2基因转染6 d后细胞生长速度明显超过对照组,MTT法结果显示bcl-2基因转染第24,48,72 h, A490 nm值分别为4.15±0.31,5.98±0.56,8.94±0.79,对照组分别为3.01±0.20,4.76±0.52,7.69±0.84,两组相比较具有显著性差异(P＜0.05). 结论:bcl-2基因转染使GES-1细胞稳定且高表达Bcl-2蛋白,并促进了细胞增殖.     

AKTIP基因真核表达载体的构建及其在GES-1细胞中的表达

目的:构建人蛋白激酶B相瓦作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIP cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,Western Blot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.     

转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9706细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响

目的:探讨转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9709细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响.方法:将杜氏盐藻14-3-3基因cDNA序列分别亚克隆入表达载体pEGFP-C1和pcDNA3.1(+)的Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ位点,构建真核表达载体pEGFP-C1-14-3-3和pcDNA3.1(+)-14-3-3,采用脂质体方法转染EC9706细胞,同时设立空载体对照和空白对照,荧光显微镜观察pEGFP-14-3-3融合蛋白在EC9709细胞中的定位;G-418筛选稳定转染pcD-NA3.1(+)-14-3-3的细胞株,采用RT-PCR和Western blotting法检测14-3-3基因的表达;Western blotting检测3种细胞中Bcl-2和Caspase-9蛋白的表达.结果:pEGFP-14-3-3融合蛋白定位于EC9706细胞的细胞核;通过G-418筛选,最终获得稳定表达盐藻14-3-3基因的转染细胞株;与转染空载体和空白对照的EC9706细胞相比,转染pcDNA3.1(+)-14-3-3的EC9706细胞中Bcl-2蛋白表达量明显增高[(1.60±0.20)、(0.90±0.15)和(2.40±0.10);F=69.889 7,P＜0.001],而Caspase-9蛋白表达量明显降低[(1.00±0.04)、(1.40±0.08)和(0.40±0.05);F=217.066 7,P＜0.001].结论:杜氏盐藻14-3-3基因可能在EC9706细胞凋亡过程中发挥了抑制作用.     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

HIF-1α对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用.方法 将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full lengthHIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染人SiHa细胞中,分别命名为fL HIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组.应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测.应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况.结果 免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下.fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pc DNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在官颈癌的发生发展中可能起着重要作用.     

SOCS1对α干扰素调节乙肝病毒复制作用的影响

目的 研究细胞因子信号阻抑蛋白1(SOCS1)对α干扰素(IFN-α)调节乙型肝炎病毒(HBV)复制作用的影响.方法 HepG2.2.15细胞按处理方法分为3组:空白组(未加IFN-α处理)、对照组(加空质粒转染)、实验组(加pcDNA3.1-SOCS1转染),转染后检测对照组与实验组有质粒表达后,用1 000 IU/...     

NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究

目的 构建大鼠NELL2基因真核表达载体peDNA3.1(-)-NELL2的mieroRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应.方法 从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的 片段克隆至表达载体peDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2.针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4).将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组).采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染peDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组.结果 酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确.Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P＜0.05或P＜0.01).结论 成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒.证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应.     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

过表达Plk-1对gemcitabine诱导的胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的观察Plk-1基因过表达对gemcitabine诱导胰腺癌细胞AsPC-1化疗敏感性的影响。方法①将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组,转染空载体设为对照组,无处理组设为空白组,转染24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,利用RT-PCR法及Western blot鉴定AsPC-1细胞内Plk-1基因和蛋白表达水平。②采用流式细胞术检测转染组细胞凋亡的改变。③不同浓度gemcitabine作用于转染细胞,MTT法测定转染48 h后细胞增殖能力。结果①测序结果表明成功的从AsPC-1细胞总RNA中扩增Plk-1基因。RT-PCR结果表明：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1 mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Western blot结果显示：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1基因的蛋白表达水平为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。②在gemcitabine作用下,pcDNA3.1/Plk-1转染组细胞凋亡率明显低于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。③AsPC-1/Plk-1转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论胞浆过表达Plk-1活性分子可明显降低gemcitabine诱导的AsPC-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的耐受性。     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

过表达连接蛋白32对人肝癌细胞株MHCC-97H体外侵袭能力的影响

目的 探讨过表达连接蛋白32(Cx32)对人肝癌细胞株MHCC-97H体外侵袭能力的影响.方法 应用Lipofectamine 2000将pcDNA 3.1(-)/Cx32重组质粒转染至MHCC-97H细胞,G418稳定筛选.采用Western blot法检测Cx32蛋白表达,划痕标记荧光传输实验显示细胞通讯功能的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力的改变.结果 转染pcDNA 3.1(-)/Cx32重组质粒使得MHCC-97H细胞过表达Cx32蛋白.与正常对照组和转染空质粒组细胞相比,转染pcDNA 3.1(-)/Cx32重组质粒并过表达Cx32的细胞胞间通讯功能增强,细胞侵袭能力减弱.结论 Cx32在人原发性肝癌的侵袭过程中可能起抑制作用.     

人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。