人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆抗原处理相关转运体亚基TAP2基因片段并构建真核表达载体。方法 从EB病毒刺激的人B淋巴母细胞系(B-LCL)中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出TAP2 cDNA。将TAP2 cDNA插入表达载体pcDNA3．1／VS-His-TOPO中,构建重组表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO-TAP2,并进行测序分析。结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人TAP2 cDNA。结论 获得了人TAP2 cDNA并构建了重组真核表达载体,对TAP2基因产物在体外表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤基因治疗方面的作用具有重要的意义。     

真核表达质粒pIRES2-eGFP-Annexin A2的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒plRES2-eGFP-Annexin A2,并在真核细胞293T中表达.方法:将质粒pCMV5.Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒plRES2-eGFP连接,酶切鉴定及测序正确后,脂质体介导法转染293T细胞,荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达.结果:构建的质粒plRES2eGFP-Annexin A2转染293T细胞后,目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高.结论:成功构建pIRES2-eGFP-Annexin A2质粒并表达蛋白,为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础.     

大鼠Ngn2基因真核表达质粒的构建

目的：构建大鼠Neurogenin2（Ngn2）基因的真核表达质粒。方法：从大鼠海马组织提取海马总mRNA ,RT-PCR获得Ngn2基因cDNA,构建重组质粒pSecTag2／HygroB-Ngn2, XhoⅠ和HindⅢ双酶切、测序鉴定重组质粒。结果：RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pSecTag2／HygroB-Ngn2重组质粒构建成功。结论：成功构建了大鼠Ngn2基因的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步Ngn2基因对神经损伤修复作用的研究奠定基础。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

人rgs4真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建人rgs4基因真核表达质粒。方法采用RT-PCR方法,扩增人rgs4基因片段,插入真核表达质粒pcDNA3．1中,转化大肠杆菌DH5a,通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和测序验证阳性重组克隆。结果RT—PCR自人胚肾上皮细胞（HEK293）中扩增出目的基因片段,插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致,测序结果证明为人rgs4基因。结论成功构建了人rgs4编码框全长的真核细胞表达质粒。     

pSG5-Oct4真核表达质粒的构建及瞬时表达

目的 克隆人胚胎干细胞的关键基因Oct4,构建真核表达质粒pSG5-Oct4,并检验其在胎儿胰岛间质细胞中的瞬时表达.方法 通过RT-PCR从胎儿骨髓间充质干细胞克隆出基因Oct4的全长序列,插入真核表达栽体pSG5中,经筛选阳性克隆、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定及测序分析后,用Fugene HD转染试剂转染胎儿胰岛间质细胞,采用RT-PCR和免疫细胞化学染色检测重组质粒pSG5-Oct4在胎儿胰岛间质细胞中的表达情况.结果 经RT-PCR扩增得到大小约1.1 kb的条带,测序与GenBank中Oct4(NM_002701.4)基因序列的同源性达97%;EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切重组质粒,琼脂糖凝胶电泳分析插入基因的大小和方向均正确;经RT-PCR和免疫细胞化学染色检测,pSG5-Oct4转染胎儿胰腺间质细胞后能表达Oct4蛋白.结论 本实验成功构建了真核表达质粒pSG5-Oct4,且目的 基因可在胎儿胰岛间质细胞瞬时表达,为进一步研究Oct4在真核细胞中的调节作用及后续实验奠定了基础.     

FSHR部分基因的真核表达质粒构建和生物信息学分析

目的克隆FSHR基因部分片段(145～330bp)(FSHRn),构建真核表达重组质粒,预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性。方法提取小鼠睾丸组织的总RNA,利用RT-PCR技术反转录成cDNA,按照GenBank中小鼠FSHRN-端序列设计引物,扩增基因片段并插入pcDNA3.1/myc-His(-)B载体,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定后用VectorNTI9.0软件作生物信息学分析。结果扩增片段长度为186bp,测序结果与已知序列吻合,重组真核表达质粒经PCR和双酶切鉴定获得正确重组子,生物信息学分析其编码蛋白抗原性肽段主要集中在15～20aa、22～27aa、32～36aa、42～48aa、58～67aa,与人的基因同源性为90%。结论成功克隆了FSHRn基因片段并构建了pcDNA3.1/FHSRn真核表达重组质粒;FSHRn具有良好的抗原性,FSHRn蛋白可作为良好的动物候选疫苗,为此段蛋白的深入研究和人类男性避孕疫苗的研制打下基础。     

小鼠Hsp84真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建小鼠Hsp84基因真核表达质粒。方法：采用逆转录、热降落PCR方法，扩增BALb／c小鼠Hsp84基因片段。将其连人pMD18-T载体，筛选阳性克隆、测序验证。然后以重组T载体为模板，PCR扩增目的序列，插入真核表达质粒pcD—NA3.1中，转化大肠杆菌DH5α，通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和验证阳性重组克隆。结果：RT—PCR自小鼠脑组织中扩增出目的基因片段，克隆人pMD18-T载体后，测序结果证明为BALb／c小鼠Hsp84基因．插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致。结论：成功构建了小鼠Hsp84编码框全长的真核细胞表达质粒。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

人乳头瘤病毒58型E7基因重组真核表达质粒的构建与序列分析

目的:构建含人乳头瘤病毒58型(HPV58)E7基因的真核表达质粒,获得HPV58感染人后病毒基因结构的基本信息。方法:用HPV型特异性引物扩增出HPV58型E7 DNA,将HPV58 E7 DNA与PBS-T载体连接,获得克隆重组体HPV58 E7-PBS-T,经双酶切鉴定后,将E7基因与真核表达载体PCDNA3.1连接,然后经双酶切、测序鉴定,通过GenBank的数据库分析软件对HPV58型E7基因进行同源性分析。结果:双酶切重组DNA结果显示,重组体中HPV58型E7基因片段和载体DNA大小与预期计算一致,经BLAST比对,与GenBank数据库中的HPV58型E7基因序列具有高度的同源性,其中与1991年日本学者最早报道HPV58型E7基因相比,仅125位一个碱基的差异,即C-T的突变;推导相应的氨基酸由脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu)。结论:构建了含HPV58型E7基因的真核表达质粒,其基因序列与报道的基因序列高度同源,其微小差异对功能有无影响有待探讨。该重组质粒的构建为HPV58型E7基因及表达蛋白的功能研究奠定基础。     

人血管紧张素转换酶2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人血管紧张素转换酶2基因(ACE2),并构建其真核表达载体。方法用Trizol试剂从人肺组织提取总RNA,然后经逆转录得到人ACE2的cDNA。半巢式PCR方法扩增人ACE2基因后,先进行T-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,接种含IPTG和x-Gal平板筛选重组子,并进一步亚克隆至真核表达质粒载体pcDNA3.1( )。经PCR扩增、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果获得了人ACE2的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。结论人血管紧张素转换酶2是SARS冠状病毒的功能受体,与SARS冠状病毒Spike蛋白上的受体结合域相结合,在SARS冠状病毒感染和传播中起重要作用,本工作为研究SARS冠状病毒感染及跨种属传播机制奠定了基础。     

靶向增强绿色荧光蛋白shRNA的真核表达载体构建

目的构建针对增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果测序证实针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6构建正确;荧光显微镜下观察转染pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6质粒的CHO细胞中,荧光明显减少。结论针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6能明显干扰EGFP的表达。     

survivin启动子的真核表达载体构建

目的构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv。方法用PCR扩增survivin启动子,构建其真核表达载体并检测survivin启动子的活性。结果PCR成功扩增出survivin启动子,其真核表达载体构建成功。结论survivin启动子能驱动EGFP的表达,证明其具有活性。     

HBV全基因真核细胞表达载体的构建及表达

目的：构建全基因HBV真核细胞表达载体,并对其在细胞内的复制、转录、翻译进行研究。方法：采用分子亚克隆技术,将长约3.2Kb的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pBK-CMV折EcoPI位点,构建的pKB-HBV经FUGENE^TM6导入人肝癌细胞系SMMC－7721细胞中。结果：经PCR、RT－PCR验证pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制和转录。固相放免法显示HBV转染细胞内的HBsAg、HBeAg的合成和分泌。免疫组化法证明,胸内浆型分布为主的HBcAg的表达。结论：HBV全基因真核细胞表达载体pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制、转录及表达。     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫黏附蛋白33基因(adhesionprotein33gene,ap33gene)真核表达载体。方法提取阴道毛滴虫分离株基因组DNA,PCR扩增黏附蛋白33基因,克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定出的重组质粒pMD-18T-ap33和pcDNA3.1( )空质粒经BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,凝胶电泳后回收ap33目的基因和pcDNA3.1( )空质粒酶切片段,将ap33基因亚克隆入pcDNA3.1( )载体并进行筛选和鉴定。结果PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白33基因,重组质粒pMD-18T-ap33经双酶切,PCR及序列分析,ap33基因的长度为930bp,与GenBank上公布的ap33基因序列同源性达99%。经凝胶电泳、PCR鉴定和限制性酶切鉴定,构建出pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。结论成功构建了阴道毛滴虫pMD-18T-ap33克隆质粒及pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。     

抗药性相关糜蛋白酶基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建抗药性相关基因真核表达载体。方法：采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系cDNA文库为模板，扩增出抗药性品系中高表达糜蛋白酶(chymotrypsin)基因，经T／A克隆测序鉴定后，扩增、纯化质粒，经双酶切后纯化目的片段，克隆到真核荧光表达载体pEGFP—C3中。结果：PCR和酶切鉴定表明，构建成功真核荧光表达载体pEGEP—C3／chymotrypsino结论：PCR加双酶切鉴定的方法构建表达质粒，迅速省时，结果可靠。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能,构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列,亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1,脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞,采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2,并成功转染入SHG-44细胞,为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。