3种不同载体对卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

目的以小鼠成熟卵母细胞(MⅡ期)为试验对象,应用3种不同载体对其行玻璃化冷冻,旨在分析载体对冷冻效果的影响。方法采用玻璃化冷冻技术冻存昆明种小鼠成熟卵母细胞,设新鲜对照组和玻璃化冷冻组,玻璃化冷冻组又分为开放式脉管(OPS)组、自制麦管组和Cryoleaf组。比较冻融后鼠卵的存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果新鲜对照组和玻璃化冷冻组的受精率、卵裂率差异无统计学意义,但囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05);OPS组与自制麦管组的鼠卵存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;OPS组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;自制麦管组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),而受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义。结论载体的不同会对卵母细胞玻璃化冷冻效果形成一定程度的影响。     

冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

目的探讨不同冷冻载体对小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻回收率、复苏率和解冻后胚胎发育潜能的影响。方法以小鼠卵母细胞为实验材料,以玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵母细胞,分别以冷冻叶片（A）组、冷冻小钩（B）组、电镜铜环（C）组、自制冷冻叶片（D）组为冷冻载体冷冻小鼠卵母细胞,通过对解冻后卵子回收率、复苏率、卵子受精率及早期胚胎发育率等分析判断冻存效果。结果回收率D组明显低于其他3组,差异有统计学意义（P〈0.01）;D组与其他3组卵母细胞冷冻保存后卵子复苏率、胚胎受精率、继续发育潜能的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 4种玻璃化冷冻载体都是小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体,自制叶片组的卵子回收率明显低于其他3组,需更进一步熟练叶片制作的技术和实验人员操作技能。     

小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.     

不同冷冻载体对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

目的:探讨玻璃化冷冻小鼠成熟减数第二次分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的最佳冷冻载体及冷冻方法。方法:用乙二醇和蔗糖为玻璃化冷冻保护剂,将小鼠成熟MⅡ期卵母细胞分为冻融、暴露和对照组。冻融组分别采用普通麦管、封闭式拉细麦管(CPS)和开放式拉细麦管(OPS)作载体,采用玻璃化快速冷冻和快速复温的方法冻存小鼠成熟卵母细胞;暴露组卵母细胞仅暴露在冷冻和复苏液中,不进行冷冻;对照组卵母细胞不接触冷冻和复苏液。观察各组处理后卵子回收、受精、卵裂等情况。结果:冻融组普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞回收率分别为92.0%、92.3%和72.3%,OPS处理卵母细胞的回收率显著低于普通麦管和CPS处理的卵母细胞(P<0.001);普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞复苏存活率分别为43.5%、72.2%和76.5%,CPS和OPS处理卵母细胞的复苏存活率显著高于普通麦管组处理的卵母细胞(P<0.001)。冻融、暴露和对照组的卵裂率分别为38.6%、69.2%和73.5%,冻融组显著低于暴露和对照组(P<0.001)。结论:CPS法在玻璃化冷冻保存成熟的卵母细胞方面有价值。     

小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的　对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究。方法　用两种玻璃化冷冻液EFS4 0 (高钠 )、DEFS4 0 (低钠 )对ICR、C57BL 6J小鼠卵母细胞进行冷冻 ,0 5mol L蔗糖液解冻 ,体外授精前对部分解冻后的C57BL 6J小鼠卵母细胞进行透明带切割。结果　DEFS4 0冷冻液冷冻效果明显高于EFS4 0冷冻液 ,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达 75 2 %、体外授精率 (2 4 6 % )与对照组相比差异无显著性 ,C57BL 6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为 87 1%、卵母细胞切割后体外受精率 (36 0 % )与对照组相比差异也无显著性。结论　冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果 ,用DEFS4 0 (低钠 )冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

人卵母细胞玻璃化冷冻的临床应用及成功分娩

目的探讨人卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及临床应用价值。方法将从促排卵周期获得的人的卵母细胞用冷冻环进行玻璃化冷冻保存,复苏后行卵细胞浆内单精子注射-胚胎移植,观察复苏后卵母细胞形成胚胎的发育能力。结果冷冻后融解235个卵母细胞,存活169个（71．9％,169／235）,受精122个（72．2％,122／169）。移植11例,获得临床妊娠2例。第1例于2005年12月15日妊娠35^＋2周行剖宫产,为双胎女婴,均发育正常。第2例为单胎妊娠,现妊娠16周,目前胎儿及孕妇健康。结论卵母细胞玻璃化冷冻是一种较理想的保存女性生育力的方法,但是其技术应用于临床有待进一步研究和实践。     

玻璃化冷冻研究进展

玻璃化冷冻是继程序化慢速冷冻之后发展起来的一种新的冷冻方法，它操作简单且不需要高精密的程序降温仪。玻璃化冷冻的效果与冷冻保护剂的种类和浓度、缓冲介质、冷冻方法、冷冻容器、冷冻速率等因素有关。本文叙述了近10余年玻璃化冷冻的研究进展。     

叶酸在玻璃化冷冻中对小鼠卵母细胞的影响

目的探讨叶酸对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响。方法将卵母细胞随机分为新鲜组、玻璃化冷冻组、叶酸低、中、高剂量(50、100和200mg/L)组。比较各组卵母细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量、活性氧(ROS)水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果低、中、高剂量的叶酸均可增加卵母细胞内GSH含量(F=23.814,P<0.01),降低卵母细胞内ROS水平(F=11.209,P<0.01),提高卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率(χ2=124.815、21.117、15.172和9.834,P<0.05)。结论叶酸对玻璃化冷冻卵母细胞具有保护作用,可能与其抗氧化作用相关。     

左卡尼汀对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞体外受精结局的影响

目的：研究左卡尼汀对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。方法：将卵母细胞分为新鲜组（存活卵数243个）,玻璃化冷冻组（解冻卵数282个）,左卡尼汀高、中、低剂量（2．0、1．0、0．5 g／L）组（解冻卵数分别为285、280和279个）。观察各组卵母细胞中GSH含量、ROS水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果：5组卵母细胞GSH含量、ROS 水平及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均有统计学意义（ F ＝881．290、182．760及χ2＝113．361、21．560、16．660、9．667,P均＜0．05）。与新鲜卵母细胞比较,玻璃化冷冻卵母细胞中GSH含量降低,ROS水平升高,卵母细胞存活率、受精率、卵裂率均降低（ P＜0．05）。左卡尼汀呈剂量依赖性地增加玻璃化冷冻卵母细胞中GSH含量,降低ROS水平（P＜0．05）;高剂量左卡尼汀可明显改善玻璃化冷冻卵母细胞的存活率（ P＜0．05）。结论：左卡尼汀可通过抗氧化作用改善玻璃化冷冻卵母细胞的结局。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

 【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

人卵母细胞的电脉冲辅助激活

[目的]探讨电脉冲刺激进行人卵母细胞的人工辅助激活的可行性。[方法]不同卵龄和来源的人卵母细胞分为4组,49个新鲜成熟的卵母细胞作为A组,42个常规体外受精(IVF)中未受精的成熟卵母细胞为B组,C组为卵浆内单精子注射(ICSI)后未受精卵母细胞57个,D组为体外培养48h的ICSI后未受精卵母细胞37个,所有卵母细胞以直流电脉冲刺激2次,观察电脉冲刺激后卵母细胞激活和胚胎发育情况。[结果]A组卵母细胞激活率为43％(21/49),与B、C、D3组相比偏低,差异具有统计学意义(P均<0.05),A组中激活后卵母细胞主要表现为一原核二极体(IPN+2PB),而C组和D组则以二原核二极体(2PN+2PB)占多数。A、B、C组激活后卵母细胞分裂率分别为81％(17/21),83％(24/29)和88％(38/43),较D组(19％,5/26)显著增加(P<0.01),在电脉冲刺激后第3天,A、B、C组分别有18％(3/17),29％(7/24),31％(11/35)的胚胎发育到8-细胞阶段。[结论]不同来源和卵龄的人卵母细胞在电脉冲刺激后表现为不同的激活类型和胚胎发育情况,直流电脉冲作为一种有效的卵母细胞人工激活方法可以应用于辅助受精。     

Experimental Study on Meiotic Spindles and Chromosomes of Mouse Mature (MⅡ) Stage Oocytes under Laser Scanning Confocal Microscopy

Taking the mouse as a model, the experimental method of observing the morphology of meiotic spindles and chromosomes in mature oocytes were investigated in order to evaluate the effects of various interventions on the quality of oocytes accurately and rapidly. Laser scanning confocal microscope (LSCM) was used to examine the meiotic spindles and chromosomes by the technologies of optical section and three-dimensional (3D) image reconstruction. The results showed that the configurations of meiotic spindles and chromosomes could be observed clearly by LSCM.The normal rate of meiotic spindles and chromosomes was 82% and 86% respectively. It was concluded that the LSCM was a valid instrument to observe the meiotic spindles and chromosomes of mature oocytes and could be used as a valid method to evaluate the quality of M Ⅱ oocytes.     

小鼠卵母细胞电激活的实验研究

目的寻找用电激活方法作小鼠体细胞克隆的适宜卵龄的卵母细胞及电激活参数。方法在0．6kV／cm、80us、2个电脉冲（2p）下，比较了注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）后13、16、19、22h卵母细胞的激活率、碎裂＋死亡率。在上述相同电脉冲下，统计了经体外培养（IVC）和新鲜的卵龄为16、19、22h的卵母细胞的激活率，碎裂＋死亡率；比较了场强分别为0．6、0．9、1．2、1．5、1．8kV／cm，电压时程分别为10、20、40、80、100、150、200 us，2P对注射HCG后16h卵母细胞的电激活效果。结果注射HCG后16、19h卵母细胞电激活率较高，分别为63．6％和76．7％，经体外培养后激活率下降，碎裂＋死亡率明显增加。在0．9kV／cm、80／100us，2P时激活率达70％～80％。在1．2kV／cm、40／80／100us、2P时，激活率达到了80％左右，碎裂＋死亡率低于16％。结论注射HCG后16h的卵母细胞为适宜的小鼠核移植的受体细胞。0．9kV／cm、80／100us，2P及1．2kV／cm、40／80／100us、2P为适宜的电激活参数。     

小鼠窦前卵泡培养成熟后卵母细胞纺锤体的变化

目的小鼠窦前卵泡体外培养得到成熟卵母细胞,观察卵母细胞的染色体和纺锤体形态,分析其变化及原因。方法完整小鼠窦前卵泡培养12 d,得到的卵母细胞进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察纺锤体和染色体的形态和分布。结果经过体外培养,得到GV、M I、MⅡ期卵母细胞分别占总数27.9%、37.2%、34.9%;GV期卵母细胞存在完整的染色质圆环,11.8%的M I期卵母细胞显示正常纺锤体和染色体;38.5%的MⅡ期卵母细胞显示正常的纺锤体和染色体。结论小鼠窦前卵泡经体外培养后能够得到成熟的MⅡ期卵母细胞,但是其效率较低。原因可能是卵母细胞骨架结构的异常使染色体分离障碍,部分卵母细胞停留于M I期;同时成熟卵母细胞的受精率低也与纺锤体异常有关。     

冷冻对人类成熟及未成熟卵发展潜能的影响

目的：探索冷冻卵子的成熟时期，方法：将153个生发泡期(GV期)人类卵子分为3组，对照组：体外培养至成熟(MⅡ期)，行单精子胞浆内注射(ICSI)，MⅡ期冷冻组：体外成熟至MⅡ，然后将MⅡ期卵子进行冷冻，解冻后将存活的卵子行ICSI；GV期冷冻组：将GV期卵子进行冷冻，解冻后体外培养至MⅡ，然后再行ICSI．用慢速冷冻快速解冻的方法对成熟的和未成熟的卵子进行冷冻和解冻，观察体外成熟情况、解冻后的存活情况、受精情况及胚胎发育情况，结果：体外成熟率：GV期冷冻组51.2％，对照组为70．0％，有显差异；受精率：3组分别为68、0％、33、3%、42.1％，有显差异．对照组的发展潜能要显优于试验组；GV期冷冻组的存活率、受精率优于MⅡ期冷冻组。结论：冷冻会对卵子的发育潜能有1定的损伤，在GV期进行冷冻可降低这种伤害。     

鼠脑神经递质受体在卵母细胞上的表达

把提取的鼠脑mRNA注射到卵母细胞内,在卵母细胞上以双电极电压钳技术研究某些递质的诱导电流。实验发现除卵母细胞本身所具有的muscarine受体外,还有多种受体明显地在卵母细胞上表达。卵母细胞膜上的表达受体的反应可分平滑型、振荡型、复合型三类。其反应类型与所开启的通道及通透离子有关。平滑型反应的受体与离子通道为一复合体,激动剂开启其自身离子通道。而振荡型反应是递质通过第二信使的介导,引起胞内Ca2+库中的Ca2+释放,开启卵母细胞膜本身的Cl－通道,产生Ca2+依赖的Cl－电流,构成振荡型电流反应的主要成分。复合型二者兼有。     

不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响

目的：：探讨不同冷冻方法对小鼠卵母细胞存活率及其发育潜能的影响。方法：采用玻璃化冷冻技术,选取开放式载体与封闭式载体分别冻存带卵丘细胞(COC)或剥除卵丘细胞(OD)的小鼠卵丘复合体,复苏后分别作体外受精,胚胎培养。结果：开放式载体冻存组存活卵数76.79%略高于封闭式载体冻存组72.98%,无统计学意义(P >0.05);两组内 COC 组的卵子存活率显著高于 DO 组,但有统计学差异(P <0.05),COC 组的受精率、囊胚率略高于 DO 组,无统计学差异(P >0.05)。结论：(1)封闭式载体有效避免了潜在的污染问题,但不同载体对卵子存活率无显著影响。(2)卵丘细胞在玻璃化冷冻卵母细胞中可以起到保护作用,并对胚胎后期的发育有一定的改善。