大鼠自体移植脾组织GAP-43+神经再生的实验研究

目的 研究大鼠自体脾组织移植术后移植脾组织GAP-43^ 神经纤维再生及分布规律。方法 健康Wistar大鼠105只，随机分为自体脾组织移植组和对照组，于术后7、15、30、60、90、120、180d取移植脾组织标本，应用免疫组化方法显示GAP-43^ 神经纤维，并用图像分析系统，对不同时相点免疫组化GAP-43^ 染色区域进行图像定量分析。结果 自体脾组织移植术后30d，移植脾组织周围大网膜内可见GAP-43^ 神经纤维，并向移植脾组织内伸展；自体脾组织移植术后60～120d，移植脾组织内再生神经纤维逐渐增多；术后180d，移植脾组织中GAP-43^ 神经纤维分布及密度接近正常。结论GAP-43^ 神经纤维于脾移植术后60d开始出现，术后180dGAP-43^ 神经纤维接近正常脾。     

臂丛损伤再生中GAP-43 mRNA及其蛋白的表达

目的：分析臂丛损伤后脊髓前角运动神经元表达GAP-43 mRNA及其蛋白的变化规律，探讨神经损伤再生的机制。方法：建立3种臂丛损伤模型：右C₇前根撕脱（A组）；右C₇前根撕脱＋同侧C5-T₁后根断离（B组）；右C₇前根撕脱+右C₅C₆间脊髓半横断（C组）。用荧光定量RT-PCR方法检测术后14 d时 C₇前角GAP-43 mRNA的表达量。用免疫组化方法检测术后1、 3、 7、14 d脊髓前角GAP-43免疫阳性运动神经元的表达。结果：对照组C₇前角GAP-43 mRNA呈低表达，损伤组GAP-43 mRNA表达显著上调。损伤组术后1 d、3 d时均未见C₇前角 GAP-43免疫阳性神经元，术后7 d各损伤组GAP-43免疫阳性神经元开始出现，14 d时免疫阳性神经元数目达到高峰。3组间比较，C组表达量最高，B组最低，A组居中。结论：臂丛损伤诱导运动神经元GAP-43 mRNA及其蛋白表达上调，GAP-43合成增加是神经元蛋白重组所致，与轴索再生和神经功能重建有关。     

臂丛损伤脊髓运动神经元与神经根GAP-43 mRNA表达

目的：探讨臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达变化及其影响因素,为臂丛损伤的修复治疗提供理论依据.方法：本实验创立三种臂丛根性撕脱伤模型：C7前根撕脱（Ⅰ组）;C7前根撕脱＋切断同侧C5～T1后根（Ⅱ组）;C7前根撕脱＋C5和C6之间作同侧脊髓半横断（Ⅲ组）.术后2周按CBS评分标准检查动物神经缺失症状,用SYBR Green荧光定量RT-PCR方法检测脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达改变.结果：根据CBS评分标准,对照组计为0分,Ⅰ组计分较低、Ⅲ组计分最高.对照组C7神经元胞体和C7神经根中GAP-43 mRNA表达量相近,但三种损伤组术后2周神经元胞体内GAP-43 mRNA表达均上调,而神经根内表达却下调.结论：（1）臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体GAP-43 mRNA表达受突触前机制的调控;（2）臂丛损伤2周时神经元胞体内GAP-43 mRNA表达呈现高峰期,此时进行神经移位术将显著提高神经修复的效果.     

神经损伤与再生中神经元GAP-43mRNA表达的原位杂交研究

目的：研究周围神经损伤过程中生长相关蛋白（GAP-43）mRNA表达的变化规律。方法：建立大鼠坐骨神经中段钳夹损伤模型，用原位杂交技术对大鼠的腰髓和背根神经节的GAP-43mRNA表达进行观察。结果：大鼠坐骨神经损伤2d后，腰髓腹角运动神经元和背根节感觉神经元可检测到GAP-43mRNA杂交信号；术后4、7和14d明显增强；术后30d减弱，60d已恢复正常。结论：周围神经损伤诱导神经元胞体GAP-43mRNA表达显著增强，表明GAP-43在神经再生过程中起重要作用。     

GAP-43原核表达载体的构建、表达及抗GAP-43单克隆抗体的制备

目的：原核表达神经生长相关蛋白-43(GAP-43)，并制备抗GAP-43的单克隆抗体(mAb)。方法：从含有GAP-43 cDNA的质粒中，用PCR扩增GAP-43 cDNA的全长编码序列，克隆人表达载体pGEX-4T-1中，构建GAP-43的高表达工程菌，并以IPTG诱导表达日的蛋白。通过亲和层析法纯化表达的GST-GAP-43融合蛋白，并以此为抗原制备mAb。结果：酶切鉴定证明，获得含有目的基因片段的重组质粒.表达的GST-GAP-43融合蛋白以可溶性的形式存在。ELISA检测表明，获得的抗GAP-43 mAB效价为1：10^8，其IgG的亚类为IgG2a，亚型为κ型。用Western blot检测大鼠脑匀浆蛋白，在相对分子质量(Mr)为50000处有一条特异性带。用此mAb进行荧光免疫法检测表明，在致敏豚鼠的肺切片中，有GAP-43阳性的神经纤维。结论：所获抗GAP-43mAb的特异性强、效价高，对进一步研究(GAP-43在神经系统中的作用提供了有用的试剂。     

周围神经损伤诱导的GAP-43mRNA表达及神经元超微结构变化

目的 :研究周围神经损伤与再生过程中神经元GAP 4 3mRNA表达及细胞超微结构变化。方法 :原位杂交组织化学法 ,超薄切片透射电镜观察。结果 :坐骨神经损伤后 ,神经元GAP 4 3mRNA表达增加 ,神经再生完成后表达下降。运动神经元粗面内质网减少 ,游离核糖体增多 ,感觉神经元粗面内质网移向细胞边缘。结论 :神经元GAP 4 3mRNA表达受轴突断裂诱导显著升高 ,并与神经元再生状态密切相关。周围神经损伤后 ,神经元的超微结构变化与GAP 4 3mRNA表达增加相符。     

新生大鼠缺氧缺血损伤后心肌细胞GAP-43的表达

目的研究生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)在新生鼠缺氧缺血损伤后心肌细胞中的差异表达及其临床意义。方法取42只7日龄Wistar大鼠随机分为正常对照组和缺氧缺血组。大鼠分别于缺氧缺血后2d,3d,7d断头处死取心肌,应用免疫组化法检测心肌细胞上GAP-43的表达。结果缺氧缺血组GAP-43的表达较对照组明显增加,在缺氧缺血后2d至7d差异有显著意义(P<0.05)。结论缺氧缺血大鼠心肌GAP-43表达呈时间依赖性变化,与心肌细胞损害密切相关。     

大鼠坐骨神经损伤与再生中GAP－43表达的实验研究

用免疫组化技术对６０只大鼠坐骨神经切断、卡压和再卡压损伤后不同时期的ＧＡＰ－４３表达作了观察．观察结果：（１）大鼠坐骨神经卡压或切断后，前角运动神经元、后根神经节细胞和坐骨神经纤维均产生免疫反应阳性，其中７ｄ组近段和１４ｄ组远段坐骨神经纤维为强阳性，（２）３０ｄ组各部免疫反应减弱，６０ｄ组基本恢复正常；（３）３０和６０ｄ组的再卡压损伤的各部均较同期其他损伤组免疫反应为强；（４）伤侧腰骶髓前角运动神经元染色逐渐减弱．ＧＡＰ－４３免疫反应结果显示，神经元胞体部分随再生期延长而逐渐减弱，周围部由近至远逐渐增强，又逐渐恢复至正常水平．结果提示ＧＡＰ－４３主要由神经元胞体所产生，随轴突逐渐转运至损伤和再生处，表明了此种蛋白参与神经再生，在神经再生过程中一直起着重要的作用．     

大鼠坐骨神经损伤与再生中GAP－43表达的实验研究

用免疫组化技术对６０只大鼠坐骨神经切断、卡压和再卡压损伤后不同时期的ＧＡＰ－４３表达作了观察．观察结果：（１）大鼠坐骨神经卡压或切断后，前角运动神经元、后根神经节细胞和坐骨神经纤维均产生免疫反应阳性，其中７ｄ组近段和１４ｄ组远段坐骨神经纤维为强阳性，（２）３０ｄ组各部免疫反应减弱，６０ｄ组基本恢复正常；（３）３０和６０ｄ组的再卡压损伤的各部均较同期其他损伤组免疫反应为强；（４）伤侧腰骶髓前角运动神经元染色逐渐减弱．ＧＡＰ－４３免疫反应结果显示，神经元胞体部分随再生期延长而逐渐减弱，周围部由近至远逐渐增强，又逐渐恢复至正常水平．结果提示ＧＡＰ－４３主要由神经元胞体所产生，随轴突逐渐转运至损伤和再生处，表明了此种蛋白参与神经再生，在神经再生过程中一直起着重要的作用．     

GAP- 43干扰RNA表达载体的构建与鉴定

目的：构建GAP-43小干扰RNA（SiRNA）的表达载体并在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12中验证其抑制效果。方法：利用设计软件根据GAP-43 mRNA序列没计特异性SiRNA插入序列，体外合成该序列后将其定向克隆入真核表达载体pRNAT HL1／Neo。以Lipofectamine^TM2000试剂转染GAP-43-SiRNA表达载体至PC12细胞中，以NGF诱导PCI2细胞GAP-43的表达，以免疫组化方法鉴定GAP-43-SiRNA对GAP．43表达的抑制效果。结果：DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT HL1／Neo的SiRNA插入序列完全正确，GAP-43-SiRNA表达载体转染PC12细胞后可特异性抑制NGF诱导的PC12细胞的GAP-43的表达。结论：GAP-43-SiRNA表达载体构建成功，为后期研究GAP-43在少突胶质细胞前体上表达的意义奠定了基础。     

大鼠脑梗塞灶周围区GAP-43免疫组化反应的观察

目的 探查脑梗塞灶周围区GAP-43表达的结构和时间.方法 运用电凝阻断大脑中动脉脑局部缺血模型和免疫组化(ABC)染色方法,对38只SD大鼠进行了研究.结果 GAP-43阳性反应发生于脑梗塞灶周围区的神经元的胞体和突起.其表达高峰在脑梗塞3～7d,随后逐渐减弱.神经元突起的阳性反应显示不同的形式和时相,其反应部位邻近梗塞区,在脑缺血2～3w,其显示强反应,没有发现胶质细胞的阳性反应.结论 局灶性脑缺血诱导GA-43蛋白质在梗塞灶周围区神经元表达,提示缺血区周边皮质神经元有生长和修复反应倾向.     

糖尿病大鼠海马生长相关蛋白GAP-43表达的研究

目的:确定链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠早期海马区生长相关蛋白(GAP-43)的表达,研究GAP-43在糖尿病时海马组织中的变化并讨论其意义。方法:SD雄性大鼠16只分为对照组和糖尿病组。用STZ制作糖尿病大鼠模型,饲养5 d,然后测血糖以确定模型大鼠成功。4周后进行灌注固定,按要求进行组织学病理检查和免疫组织化学方法观察糖尿病组和对照组的大鼠海马CA1、CA2、CA3和CA4区GAP-43的表达情况。结果:与对照组大鼠比较,糖尿病大鼠血糖明显升高(P0.05),部分锥体细胞的胞体明显增大,核显著着色;海马各区GAP-43的表达显著,特别是CA1和CA3区的表达增高更为显著(P0.05),同时海马各区GAP-43阳性颗粒平均灰度值明显降低(P0.05)。结论:结果表明,在糖尿病大鼠早期海马中GAP-43的表达发生了改变,提示大脑出现了实质性损伤并伴有再生,而这些改变主要发生在记忆相关的CA1和CA3区,这对研究糖尿病性神经病变具有重要意义。     

神经生长相关蛋白GAP-43在脊髓损伤后不同时段的表达

目的探讨成年大鼠脊髓损伤后不同时段神经生长相关蛋白GAP-43表达的改变及其在脊髓损伤修复中的意义。方法应用改良的Allen’s法和数字化脊髓损伤模型制备仪建立大鼠脊髓损伤模型,用免疫组织化学方法检测脊髓在损伤后不同时段GAP-43的表达,分析免疫阳性细胞数和细胞的积分光密度值,资料用q检验进行统计分析。结果GAP-43表达于脊髓神经元胞浆及突起中,在前角运动神经元中更为明显,损伤后一周内免疫反应逐渐增强,损伤后第5天积分光密度值（10D）达到高峰（P〈0．01）,2周后明显下调（P〈0．05）。结论脊髓损伤可能诱导损伤区GAP-43表达,在损伤后7d左右表达高峰期出现,提示其可能参与了脊髓损伤神经的生长修复过程。     

GAP-43治疗大鼠完全性脊髓损伤后GFAP表达的变化及意义

目的:通过制备完全性脊髓损伤(SCI)成年SD大鼠模型,研究生长相关蛋白(GAP-43)治疗大鼠SCI后胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的变化,探讨GAP-43在再生修复中的作用,为临床治疗提供实验参考。方法:咬除T7-T8棘突及相应椎板,用剪刀将脊髓完全横断,制成SCI模型。雌性8周龄SD大鼠75只,随机分为三组:GAP-43抗体组、GAP-43抗原组、对照组,每组25只。使用直接注射法将GAP-43抗原和GAP-43多克隆抗体分别注入抗原组和抗体组的大鼠脊髓的断端,观察各组大鼠肢体功能的恢复情况,用BBB评分法进行不同时段的行为学评分、免疫组化染色及图像分析方法观察GFAP的表达变化,并对其进行相关性分析。结果:对照组大鼠在不同时间段的行为学评分最低,抗原组评分最高;抗原组GFAP阳性细胞显著增多,而抗体组晚期则显著减少。结论:GAP-43可促进星形胶质细胞增生,而GAP-43抗体对星形胶质细胞的增生则表现为抑制作用。本实验结果表明GAP-43对脊髓损伤具有较好的治疗作用。     

电针、NGF对臂丛前索损伤再生过程中脊髓运动神经元GAP-43表达的影响

应用免疫组织化学方法 ,观察了豚鼠臂丛前索损伤与再生过程中脊髓运动神经元生长相关蛋白 ( GAP-4 3 )的表达以及电针、NGF对其表达的影响。结果表明 ,未受损神经的神经元 GAP-4 3呈弱阳性表达 ;但 GAP-4 3在神经损伤初期的表达显著增强 ,随着轴突不断生长 ,表达强度又逐渐减弱 ;电针、NGF能够加快其减弱速度 ,特别是电针能够显著加快 GAP-4 3恢复弱阳性表达。由此可以认为 ,神经元 GAP-4 3含量变化不仅能够反映轴突生长锥生长与靶器官的接触 ,还可表达再生轴突与靶器官之间功能联系的完善程度。电针促进其完善的作用优于 NGF,可能与电针对靶肌肉直接刺激性的调节作用有关     

生长相关蛋白GAP-43的研究现状

在分子水平 ,神经发育和再生时轴突的生长与一组生长相关蛋白 (ＧｒｏｗｔｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎｓ ,ＧＡＰｓ)的表达有关 ,这些ＧＡＰｓ被认为在神经生长阶段起着特殊作用[1] 。根据其表达与轴突生长的关系可将ＧＡＰｓ分为两类 :一类与远向延伸的轴突本身有关     

低氧对发育期幼鼠大脑皮层GAP-43表达的进行性影响

目的：观察慢性间断性低氧（CIH）对发育期幼鼠大脑皮层生长相关蛋白（GAP-43）表达的进行性影响。方法：雄性21日龄SD幼鼠60只,体质量50±5g,随机均分为对照组和慢性间断性低氧组（CIH组）,每组30只,每组又分为2,4,6 w三个时间点,每个时间点10只幼鼠。CIH组每日间断缺氧8h,连续缺氧2,4,6 w。利用免疫组化方法检测幼鼠大脑皮层神经元GAP-43的表达。结果：与对照组比较,CIH组各时间点GAP-43的COD值均高于对照组对应时间点,差异具有显著性（P〈0.05）。结论：发育期幼鼠对CIH造成的脑损伤具有一定的代偿修复能力。     

GAP-43免疫反应神经纤维对发育中大鼠脾脏支配的研究

本实验用免疫组化方法研究了含生长相关蛋白（GAP－43）的神经纤维在新生、幼年、成年大鼠脾脏的分布及发育规律、结果显示，在出生第1d，GAP－43免疫反应阳性神经纤维团簇即出现于尚在形成中的白髓（原基）中．根据形态可将它们分粗直和细网两种类型．至生后第10d，随着脾脏的迅速发育，GAP－43免疫反应阳性神经纤维的密度也达最高峰，它们大量出现于脾脏的血管系统周围和白、红髓内，其形态演变为具有膨体的细纤维．在生后20d，除脾脏的血管周围外，GAP－43阳性纤维密度有所下降，只出现于脾小体和被膜等结构内。在成年大鼠脾脏，除上述部位外，阳性纤维明显见于发育成熟的小梁中。本研究发现，GAP－43免疫反应阳性神经纤维密度在脾脏发育各阶段有所不同，以生后第10d为最多．本研究还就含GAP－43神经在发育中脾脏的分布规律与含TH能神经成分做了比较．     

GAP-43治疗大鼠脊髓横断后神经中丝NF200表达的变化

通过制备成年SD大鼠完全性脊髓损伤模型,研究生长相关蛋白(GAP-43)治疗大鼠脊髓损伤后神经中丝(NF200)表达的变化,探讨GAP-43在再生修复中的作用,为临床治疗提供实验依据。实验采用雌性8周龄SD大鼠75只,制成脊髓损伤模型后随机分为三组:GAP-43抗体组、GAP-43抗原组和对照组,每组25只。使用直接注射法将GAP-43抗原和GAP-43多克隆抗体分别注入抗原组和抗体组的大鼠脊髓的断端,对照组仅切断脊髓而不给药,最后观察各组大鼠肢体功能的恢复情况。用BBB评分法对不同时段大鼠的行为学表现进行评分,用HE染色及免疫组化染色观察NF200的表达,并对其进行相关性分析。结果发现对照组在不同的时间段行为学评分最低和抗原组评分最高,脊髓损伤区病理改变明显好转,NF200的表达呈进行性增高,且前角神经元NF200的表达早于后角神经元。抗体组早期恢复出现明显的停滞状态,但停药后能很快恢复。说明GAP-43能促进损伤脊髓的恢复,而抗体对损伤脊髓恢复的影响是可逆的,这对于脊髓再生的研究是一种值得探讨的新方法,对进一步探索脊髓损伤的治疗具有重要的意义。     

成年大鼠视神经夹伤后TLR4与GAP-43表达时程的比较

目的:明确视神经损伤引起的固有免疫应答反应与视网膜神经节细胞轴突再生之间的时间关系。方法:将成年SD大鼠随机分为视神经损伤组与假手术对照组,损伤组动物左侧视神经以钳夹法损伤,对照组仅暴露左侧视神经。手术第1、3、7 d处死后取左侧视神经干,用Western Blot方法检测视神经干toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)和生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)蛋白表达水平。结果:视神经干内TLR4和GAP-43蛋白在损伤后第1 d都趋于表达上调,但其后的变化趋势具有不同的时间特征,即TLR4持续上调,并在损伤后7~14 d内维持呈平台;而GAP-43的表达在损伤后第7 d呈峰值,其后逐渐下降,第14 d基本恢复至基线水平。结论:TLR4介导的固有免疫应答有可能影响视神经再生;TLR4和GAP-43表达变化的不同为进一步研究固有免疫应答对视神经再生的影响提供了有益的线索。