6A8α-甘露糖苷酶表达抑制使Jurkat细胞间的黏附性增强

目的　探讨 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制对人T淋巴母细胞Jurkat生物学行为的影响。方法　采用反义核酸技术抑制细胞中 6A8α 甘露糖苷酶的表达。用PCR检测转导基因在基因组中的整合。用单抗 6A8作探针 ,Western印迹和免疫荧光染色流式细胞术检测细胞中 6A8α 甘露糖苷酶的表达状况。用ConA结合试验检测细胞蛋白质的糖基化改变。普通光学显微镜观察细胞的形态。用DNA芯片技术分析AS细胞和M细胞mRNA表达的差异。用RT PCR和免疫荧光染色流式细胞术验证基因芯片结果的可靠性。结果　制备了 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞 (AS)。与对照细胞 (野生型细胞W和转导空载体的细胞M)相比 ,AS细胞在培养中黏附成大团块。DNA芯片分析见与M细胞相比 ,AS细胞中有 19个基因的表达上调 ,2 0个基因的表达下调。上调的基因中有一些与细胞间黏附相关 ,如CD5 4、CD11a、CD2 4、CD82、整合素αX、整合素α7、整合素αE、IL 1R、IL 2Rγ和TNFSF9。RT PCR肯定了DNA芯片分析的可靠性。免疫荧光染色流式细胞术进一步肯定了CD5 4和CD11a在AS细胞表达的上调。结论　 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制使Jurkat细胞间黏附增强 ,CD5 4和CD11a等黏附分子表达的增高可能与此相关。     

转导反向6A8α—甘露糖苷酶cDNA对抗Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡的影响

用梯形DNA电泳与Gimsa染色研究T细胞瘤细胞株Jurkat在转导编码人6A8α-甘露糖苷酶基因的反向cDNA后,对抗Fas抗体诱导凋亡敏感性的变化,并用间接免疫荧光染色（流式细胞仪）检测细胞表面Fas分子的表达。结果表明,抗Fas抗体诱导细胞24h后,野生型及转导空载载体的Jurkat细胞出现明显的梯形DNA,两者之间无明显差异,但转导反向6A8cDNA的细胞未见明显的梯形DNA。Gimsa染色结果显示转导反向6A8cDNA的Jurkat细胞中凋亡细胞数明显减少,而转导空载载体则无影响。Jurkat细胞为Fas(CD95,Apo-1)全阳性细胞,转导反向6A8cDNA或空载载体对Fas表达阳性率与Fas表达强度无明显影响。以上结果提示,转导编码6A8α-甘露糖苷酶基因的反向cDNA使人T细胞株Jurkat对抗人Fas抗体诱导的凋亡作用产生耐受。     

6A8 α-甘露糖苷酶也表达于细胞膜

目的 制6A8α-甘露糖苷酶羧基端单抗并进行鉴定,以确定6A8-α基露糖苷酶在细胞的表达部位。方法 用基因重组技术构建6A8cDNA3′端DNA片段的重组表达载体,在原核细胞表达其编码蛋白,杂交瘤技术制备单抗以3D5细胞为靶细胞,间接免疫荧光染色后,用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪鉴定单抗。结果 6A8cDNA3′端DNA在原核细胞获得表达,制备了抗6A8α-甘露糖苷酶羧基端的单抗,观察到6A8α甘露糖苷酶不仅表达于3D5细胞胞浆,也表达于胞膜。结论 成功地制德了抗6A8α-甘露糖苷酶羧基端单抗,6A8-α-甘露糖苷酶不仅表达于3D5细胞胞浆中,也表达于胞膜。     

6A8 α-甘露糖苷酶基因的mRNA表达与染色体定位

目的 对6A8α－甘露糖苷酶基因作染色体定位,比较6A8α－甘露糖苷酶mRNA在人多种免疫细胞株的表达。方法 用Fish原位杂交作染色体定位,用RT－PCR检测mRNA表达。结果 6A8α－甘露糖苷酶基因定位于人第13号染色体长臂的31－32区。6A8α－甘露糖苷酶mRNA在B细胞株SKW6高表达,在B细胞株3D5、BJAB、DESS、Daudi、Nalm6中度表达,在B细胞株Navalm,T细胞株GM、Jurkat,细胞细胞瘤细胞株U937弱表达,在T细胞株Peer,慢性髓性白血病细胞株K562极弱表达。结论 6A8α－甘露糖苷酶基因定位于人第13号染色体长臂的31－32区,其mRNA表达水平在各种人免疫细胞株不同。     

CD54和LFA-1的相互作用在6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的JurkatT细胞的黏附性增强中的作用

目的研究CD54和LFA-1的相互作用在6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞(AS)的黏附性增强中的作用。方法用细胞凝集试验确证AS细胞间黏附的增强，用细胞与细胞间黏附分子-1-人IgG的Fc片段(ICAM-1-Fc)的黏附试验和阻断性抗CD11a抗体的阻断试验研究CD54-LFA-1的作用，用单克隆抗体MEM-148检测As细胞LFA-1亲和力的变化，用单克隆抗体NKI-L16检测AS细胞LFA-1亲合力的变化，用鬼笔环肽染色细胞骨架，用Jurkat-Raji细胞间的作用作模型研究6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对T和B细胞间黏附的影响，用ConA结合试验检测细胞中蛋白质N-糖基化的变化。结果(1)AS细胞间的黏附性增强主要与CD54及CD11a表达的增强相关，也与LFA-1亲和力的增高相关；(2)AS细胞的细胞骨架发生重排；(3)As细胞与Raji细胞间的黏附也增强；(4)ConA与AS细胞的结合增强。结论CD54和LFA-1的相互作用在AS Jurkat T细胞的黏附性增强中起重要作用。细胞骨架重排也可能起作用。As细胞的蛋白质发生了N-糖基化修饰。     

BJAB细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA后发生oncosis样死亡

目的：采用形态学和分子生物学方法,分析转导6A8α-甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质。方法：用Giemsa染色、annexin-V荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法,分析细胞死亡的性质;应用ConA结合试验,检测转基因细胞6A8α－甘露糖苷酶活性的改变;应用Fluo-3探针测定细胞胞浆[Ca^2 ]i。结果：用重组腺相关病毒（rAAV)颗粒成功地将反义6A8DNA转导入了EB病毒转化的B细胞株BJAB。在克隆中,转导反义6A8 DNA的BJAB细胞在生长到3－10个细胞时死亡,而野生型、转导空载或转导正义6A8 DNA的BJAB细胞生长良好。转导反义6A8 DNA的BJAB细胞呈聚集状生长,且有大量细胞肿胀,最终死亡。Giemsa染色光镜观察、annexin-V荧光染色、梯形DNA电泳及透射电镜观察结果表明,这种死亡是一种oncosis(肿胀死）样死亡。ConA结合试验表明,BJAB细胞在转导反义6A8 DNA后的结合率升高,而转导正义6A8 DNA后的结合率则下降。另外,转导反义6A8 DNA的细胞胞浆[Ca^2 ]i升高。结论：转导反义6A8 DNA引起BJAB细胞发生oncosis样死亡,这种死亡可能与6A8α-甘露糖苷酶表达被抑制有关。     

6A8α-甘露糖苷酶表达对人鼻咽癌细胞CNE-2L2端粒酶活性和端粒长度的影响

探讨端粒长度与端粒酶活性在人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性行为改变前后的变化，建立研究恶性行为改变与端粒长度与端粒酶活性间关系的细胞模型。与6A8α-甘露糖苷酶表达正常的CNE-2L2细胞(野生型细胞W，转导空载体的细胞M及转导无关DNA片段的细胞S)相比，6A8α-甘露糖苷酶表达低下的细胞(AS)接种裸鼠皮下后的肿瘤性生长受抑。用Telo TAGGG Telomere Length Assay Kit及Telomerase PCR ELISA Kit分别测定端粒长度及端粒酶活性，用RT-PCR方法分析端粒重复序列结合因子(TRF)的转录水平。见AS细胞的端粒明显缩短(6．78Kb，W细胞为8．40Kb，M细胞为8．34kb，S细胞为9．56kb)，但端粒酶活性及端粒重复序列结合因子l和2(TRFl和2)的转录水平未见改变。实验表明，恶性行为降低的CNE-2L2细胞的端粒变短，但与端粒酶活性及TRF1／2无关，提示在CNE-2L2细胞中可能存在着端粒酶及TRF1／2以外的调节端粒长度的机制。这为研究肿瘤细胞恶性行为改变与端粒长度与端粒酶活性间关系提供了一个模型。     

干扰素α对Jurkat细胞中CCR5表达的影响

目的:通过研究干扰素(IFN-α)对Jurkat E6-1细胞内CCR5 mRNA表达及基因表达调控的影响,探讨采用干扰素治疗相关疾病的方法。方法:用不同浓度的IFN-α刺激处于对数生长期的CD4+T淋巴细胞系Jurkat E6-1细胞。培养48小时后,提取细胞的总RNA,逆转录成cDNA,进行RT-PCR和Real time-PCR扩增目的基因CCR5;利用脂质体转染荧光素酶报告系统检测Jurkat E6-1细胞内CCR5活性变化情况。结果:(1)IFN-α在浓度为100 U/ml时对CCR5 mRNA的表达有明显抑制作用;在浓度为1 000 U/ml时对CCR5 mRNA的表达表现为增强作用;在浓度为10 000 U/ml时对CCR5 mRNA的表达增强作用有所减弱。(2)当IFN-α的浓度为100 U/ml时荧光素酶的活性最低;当IFN-α的浓度为1 000 U/ml时荧光素酶的活性最高;当IFN-α的浓度为10 000 U/ml时荧光素酶的活性又有所减低。结论:IFN-α作为一类很好的免疫调节、抗病毒生物制剂,不同剂量在一定范围内会对细胞CCR5的表达有显著影响。     

一个人类α-甘露糖苷酶全长cDNA的分子克隆

用我们以往克隆到的1358bp6A8cDNA片段作探针,籍southernblot从一个人扁桃体细胞λgtllCDNA文库筛选,再用RACE方法,克隆到了一个长3300bp的6A8全长CDNA。此CDNA内有一长3188hp（57～3245hp）的开放阅读框架,编码1064个氨基酸的蛋白质。此蛋白质的氨基酸序列与大鼠一个ER－α－甘露糖苦酶（1040个氨基酸）的相同性和相似性高达78％和82％,与一个酵母－α－甘露糖着酶（1083个氨基酸）的相同性和相似性亦达33％和47％。另外,值得注意的是其260～432位氨基酸序列与人类、猪、大鼠和小鼠的多种α－甘露糖甘醇的相应氨基酸序列的相同性均高于20％,提示这段保守序列与α－甘露糖着酶的功能可能有关。     

编码与大鼠ERα-甘露糖苷酶同源的人6A8 cDNA在真核细胞的表达

目的观察６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞的表达。方法Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，构建６Ａ８ｃＤＮＡ表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ，转染ＣＯＳ－７细胞，及基因免疫小鼠。结果６Ａ８ｃＤＮＡ有４．３ｋｂ和３．５ｋｂ两种ｍＲＮＡ转录形式。４．３ｋｂｍＲＮＡ以外周血白细胞最丰富，其次为淋巴结、脾脏和骨髓，胸腺组织表达较少，胎肝则缺如。３．５ｋｂ者也以外周血白细胞最丰富，其次为肝脏、淋巴结和骨髓，胸腺和脾脏表达量最少。ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ在ＣＯＳ－７细胞表达了分子量４５０００左右的蛋白质，与单抗６Ａ８有反应。ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ基因免疫小鼠，６／１０只小鼠血清与人活化Ｂ细胞株３Ｄ５细胞膜有反应，５／５只对照小鼠血清呈阴性反应。结论６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞获得表达，但此ｃＤＮＡ非为全长。     

重组人烯醇酶-α的原核表达及生物信息学分析

目的通过原核表达技术获得人烯醇酶-α(ENO1)重组蛋白,并对表达产物进行生物信息学分析及抗体结合测定,为应用血清学检测技术进行肝纤维化早期诊断奠定基础。方法根据GenBank中登录的ENO1序列(cDNA clone BC015641, MGC:23319 IMAGE:4643088),设计特异性引物,以ENO1的cDNA为模板,用PCR技术扩增ENO1序列,构建该基因的克隆载体pEASY-T1/ENO1及表达载体pET-32a(+)/ENO1,通过IPTG诱导表达重组蛋白rENO1。利用生物信息学相关软件(ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1 server、Signal-3L、TMpred、DAS、NetPhos 2.0 Server)分析人ENO1蛋白的理化性质、信号肽、跨膜域及磷酸化位点等信息,并通过Western blot检测其与相应抗体的反应性。结果成功构建重组质粒pEASY-T1/ENO1及表达载体pET-32a(+)/ENO1,构建的克隆质粒测序结果与GenBank中登录的ENO1序列的比对符合率为100%。获得的ENO1融合蛋白分子质量约为67 ku。该ENO1片段由434个氨基酸组成,其相对分子质量为47 168.96,理论pI为7.01,是一种稳定的亲水性蛋白。该蛋白与相应抗体具有良好的反应性。结论重组人烯醇酶-α可以通过原核表达技术获得。获得的烯醇酶-α融合蛋白片段为稳定的亲水性胞外蛋白,可以与相应抗体反应,为其作为相关标志物用于肝纤维化的早期快速诊断奠定基础。     

α-甲酰基辅酶A消旋酶诊断前列腺癌的敏感性和特异性研究

随着α-甲酰基辅酶A消旋酶（AMACR,P504S）在前列腺癌鉴别诊断中的广泛应用,其问题也逐渐显现。我们采用AMACR／34βE12／p63双重免疫组织化学染色技术对AMACR的非特异性表达以及治疗后和各种特殊类型前列腺癌的表达作了较系统的研究。[第一段]     

编码与大鼠ERα—甘露糖苷酶同源的人6A8cDNA在真 …

观察６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞的表达。方法Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，构建６Ａ８ｃＤＮＡ表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ，转染ＣＯＳ－７细胞，及基因免疫小鼠。     

RNA沉默G6PD对人结肠癌细胞HIF-1α表达的影响

目的:研究siRNA干扰葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因表达的LoVo细胞在低氧环境中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平的变化及其对低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响.方法:构建靶向G6PD基因的siRNA干扰质粒载体,并转染人结肠癌细胞株(LoVo),用限制性内切酶法结合DNA测序鉴定特异重组子,RT-PCR检测G6PD mRNA表达,结合G6PD活性测定判断其干扰效率;以未转染LoVo细胞为对照,进一步观察G6PD沉默的瘤细胞在低氧环境下NADPH水平的变化,RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达水平,Western blotting检测HIF-1α蛋白水平.结果:成功构建靶向G6PD的siRNA重组质粒载体并稳定转染LoVo细胞.与未转染组细胞相比,RNA干扰G6PD使mRNA表达下降43%,酶活性下降63.5%,细胞内NADPH水平显著下降(41% vs 100%,P<0.05),但HIF-1α mRNA表达水平无明显变化,而HIF-1α蛋白显著降低.结论:低氧环境下,G6PD基因可能通过下调NADPH水平从而降低HIF-1α的稳定性,导致其水平下降,进而影响肿瘤细胞的低氧反应.     

抑制c-FLIP_L表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞的研究

目的:探讨抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞株的可行性。方法:构建c-FLIPL序列特异性siRNAs表达载体并转染A549细胞抑制c-FLIPL基因表达,化学抑制剂他莫昔芬抑制c-FLIPL蛋白表达。RT-PCR和Western blot法检测c-FLIPL的mRNA和蛋白表达的变化。Western blot法检测caspase-8的活化情况。流式细胞仪检测A549细胞凋亡率,MTT法检测联合应用RNAi+rhTRAIL和他莫昔芬+rhTRAIL对A549细胞的杀伤活性。结果:特异性siRNA片段能显著降低A549细胞中c-FLIPL的mRNA水平和蛋白水平。他莫昔芬可以显著抑制c-FLIPL蛋白的表达。两者均可以实现caspase-8的活化,并促进rhTRAIL对A549细胞诱导凋亡作用,凋亡率从2.52%提高到64.5%和59.2%(P<0.05),他莫昔芬和siRNA均可显著促进rhTRAIL蛋白对A549细胞的增殖抑制作用,抑制率分别提高到73.2%和69.5%(P<0.05)。结论:靶向抑制FLIP蛋白表达能增加A549细胞对rhTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,有利于促进rhTRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的研究应用。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞INF-α和IL-8表达的检测及临床意义

目的检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞α干扰素（IFN—α）的诱导表达及白细胞介素8（IL-8）表达,评价慢性乙肝患者外周血单个核细胞（PBMC）细胞免疫功能。方法PolyIC体外刺激正常对照组和慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus,HBV）感染组病人PBMC,取培养上清液利用病毒保护试验测定IFN—α2b治疗前后病人PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性。同时在IFN—α2b治疗前后,RT-PCR检测慢性乙肝患者不同干扰素应答组病人PBMCIL-8表达的变化。结果治疗前应答组病人（n=13）和无应答组病人（n=27）PBMC分泌的干扰素生物学活性显著低于正常对照组（n=20）（P〈0．01;P〈0．01）。应答组病人PBMC分泌的干扰素活性随治疗时间延长而增加,1个月时已显著高于无应答组病人（P〈0．01）;无应答组病人PBMC分泌的干扰素活性始终处于低下水平。治疗前,应答组病人和无应答组病人PBMCIL-8mRNA水平都显著高于正常对照组（均为P〈0．01）;治疗后,应答组病人IL-8水平随治疗时间延长而降低,1个月时已显著低于无应答组病人（P〈0．01）,无应答组病人IL8水平始终处于较高水平。结论慢性HBV感染病人的细胞免疫功能受损,不能正常表达IFN-α但应答组病人经干扰素治疗后IFN—α表达能力逐渐恢复。慢性乙肝患者PBMCIL-8表达与肝脏炎症活动有关。慢性乙肝患者PBMCIFN—α活性检测结果也许可以作为干扰素治疗预后的判断指标。     

siRNA沉默G6PD对人结肠癌细胞HIF-1α表达的影响

目的:研究siRNA干扰葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因表达的LoVo细胞在低氧环境中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平的变化及其对低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响。方法:构建靶向G6PD基因的siRNA干扰质粒载体,并转染人结肠癌细胞株(LoVo),用限制性内切酶法结合DNA测序鉴定特异重组子,RT-PCR检测G6PD mRNA表达,结合G6PD活性测定判断其干扰效率;以未转染LoVo细胞为对照,进一步观察G6PD沉默的瘤细胞在低氧环境下NADPH水平的变化,RT-PCR检测HIF-1αmRNA表达水平,West-ern blotting检测HIF-1α蛋白水平。结果:成功构建靶向G6PD的siRNA重组质粒载体并稳定转染LoVo细胞。与未转染组细胞相比,RNA干扰G6PD使mRNA表达下降43%,酶活性下降63.5%,细胞内NADPH水平显著下降(41%vs 100%,P<0.05),但HIF-1αmRNA表达水平无明显变化,而HIF-1α蛋白显著降低。结论:低氧环境下,G6PD基因可能通过下调NADPH水平从而降低HIF-1α的稳定性,导致其水平下降,进而影响肿瘤细胞的低氧...     

甲钴胺对VZV病毒感染施万细胞中朊蛋白和TNF-α转换酶表达的影响

目的:探究感染水痘-带状疱疹病毒（VZV）对人施万细胞（hSC）朊蛋白（PrP^C）、肿瘤坏死因子-α转换酶（TACE）和肿瘤坏死因子-α受体1（TNFR1）表达的影响,及甲钴胺（MCbl）的调节作用。方法:将传代培养的hSC分为：空白对照组、VZV感染组、VZV感染加MCbl干预组、VZV感染PrP^C基因（Prnp）siRNA转染细胞组、VZV感染Prnp-siRNA转染细胞加MCbl干预组。设计合成Prnp的siRNA序列转染hSC,构建PrP^C表达下调的hSC模型。以感染复数为1.0的VZV分别感染后4组细胞3 d后,加药组分别加入250μg/ml的MCbl干预。感染7 d后采用CCK-8法评估细胞活力,real time RT-PCR检测Prnp mRNA表达,Western Blot分析PrP^C糖基化的变化,免疫荧光双染检测TACE和TNFR1的表达,TACE试剂盒检测其酶活性的变化,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞上清液中可溶性TNFR1（sTNFR1）的浓度。结果:与对照组比较,感...     

糖尿病大鼠下颌下腺内细胞间黏附分子-1及肿瘤坏死因子-α的表达

目的:观察糖尿病大鼠下颌下腺内细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达变化.方法:链脲佐菌素复制SD雄性大鼠糖尿病动物模型,分别于4周、12周后测体质量和血糖,H-E染色观察下颌下腺形态学变化,免疫组织化学SABC技术,检测ICAM-1及TNF-α蛋白表达变化.结果:糖尿病组大鼠下颌下腺组织萎缩,间质纤维增生.与对照组比较糖尿病组大鼠下颌下腺导管上皮细胞ICAM-1和TNF-α表达均显著增加.结论:ICAM-1及TNF-α参与了糖尿病病理变化过程.     

细胞间黏附分子-1及肿瘤坏死因子-α在糖尿病大鼠肾内的表达

目的:观察糖尿病大鼠肾内细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达.方法:SD雄性大鼠用链脲佐菌素复制糖尿病动物模型,分别于4周、12周后测体质量、尿蛋白、血糖、尿素氮及肌酐,H-E染色观察肾形态学变化,免疫组织化学方法检测ICAM-1和TNF-α蛋白表达变化及TUNEL法观察大鼠肾皮质细...