成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的:为避免种子细胞培养过程中应用异体或异种血清的排斥及伦理问题,制备成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞,观察其增殖及生长特征。方法:实验于2005-01/2006-01在北华大学医学院细胞生物实验室完成。①细胞来源:选取北华大学医学院附属医院收治的行骨髓干细胞保健治疗的成年志愿者3名,25～30岁,对本实验均知情同意。②实验方法:空腹无菌采集志愿者外周静脉血40mL,4℃静置4h,37℃静置4h,500g离心30min,吸取上清,即自体血清。从骨髓血中提取间充质干细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增。原代记为P1,按1∶3进行传代接种,第2代记为P2,以此类推。每次传代培养的细胞接种密度严格控制与原代培养接种密度相同的水平。③实验评估:倒置光学显微镜下观察骨髓间充质干细胞生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析骨髓间充质干细胞纯度。结果:①原代及传代培养的成人骨髓间充质干细胞的光镜观察:原代培养24h后可见贴壁细胞,部分细胞有伪足伸展,第3天换液时有散在克隆生长,第5天呈克隆式增殖,10～12d可达90%细胞融合,基本铺满孔底面,呈骨髓间充质干细胞特征性的旋涡状生长,排列有方向性,旋涡中心细胞呈多层分布,细胞界限不清,细胞形态多呈梭形。传代细胞的生长较原代快,4h内即发现有贴壁细胞,24h内完全贴壁并伸展,第6～8天即可达到80%以上融合。②成人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:原代接种后2～6d为生长潜伏期,第7天开始形成大小不一的多个细胞克隆,至第9天细胞克隆进一步扩大,细胞数目呈指数级递增,为对数增殖期;第10～12天细胞生长进入平台期,原代培养结束。传至5代内的细胞生长旺盛,生长特性基本与第1代一致。③成人骨髓间充质干细胞免疫组化鉴定结果:P0、P1、P3、P5代细胞CD34染色呈阴性,而CD105染色阳性细胞在95%以上。结论:以自体血清体外扩增培养的骨髓间充质干细胞纯度高、增殖活性强,且至少在5代内生长旺盛并维持其生物特性。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

目的:观察成人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法及其生物学特性,为骨髓间充质干细胞的临床应用奠定技术基础。方法:实验于2005-12在吉林省四平市中心医院中心实验室进行。实验材料:人骨髓间充质干细胞,Ficoll淋巴细胞分离液,胎牛血清,牛血清白蛋白,α-MEM培养基,胰蛋白酶,FITC标记的CD44和CD90。实验方法:①人骨髓间充质干细胞的分离与培养:采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,条件培养基培养和扩增,倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况。②人骨髓间充质干细胞生长曲线的测定:取生长良好的P1,P5,P10细胞,用胰酶消化,接种于24孔板培养,每天各取3孔消化计数细胞,取平均值,连续培养7d,绘制生长曲线。③人骨髓间充质干细胞表面标志的测定:取生长良好P5细胞进行免疫荧光染色鉴定(CD44,CD90并设同型对照)。④人骨髓间充质干细胞的冻存及复苏:收集生长良好细胞,计数细胞密度及冻前存活率。将细胞加入到细胞冻存液中液氮冷冻保存。30d后复苏细胞,每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况。结果:①倒置显微镜下观察细胞形态:倒置显微镜下观察细胞呈纤维形,漩涡状生长。②人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:传代的细胞生长较原代要快,从第10代开始细胞生长开始出现缓慢征象。③细胞表面标记检测结果:免疫荧光染色后细胞膜着色明显,CD44,CD90阳性率均大于90%。④细胞冻存及复苏生长特性分析:椎虫蓝计数细胞存活率90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性。结论:应用密度梯度法分离法能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,能在体外长期培养,在传代培养5代内生长旺盛且生物学特性稳定。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据.目的:动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化.方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增.选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响.取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养.结果与结论:运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性.脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%).细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似.提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性.     

兔激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的培养

背景:自体干细胞移植治疗已经成为目前组织工程和再生医学研究的重点。但对于兔激素性股骨头坏死模型自体骨髓移植中骨髓间充质干细胞的体外培养研究鲜有报道。目的:抽提兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞,并行体外扩增和表型鉴定。方法:取成年大耳白兔10只,对照组2只不给任何药物;模型组8只每周2次臀肌注射甲基强的松龙8mg/kg制备兔激素性股骨头坏死模型。体外分离培养骨髓间充质干细胞;应用流式细胞仪分别检测第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD34、CD44的表达。结果与结论:经过大量激素作用后,MR灌注成像及病理切片结果显示兔激素性股骨头坏死模型组造模成功。模型组原代骨髓间充质干细胞4h内仅有少量细胞贴壁,12d左右细胞铺满瓶底的85%-90%,传代培养生长良好;第4代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型S型,第4-7天处于高速增殖期,与对照组生长曲线相近;经流式细胞术鉴定,第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34表达呈阴性,CD29,CD44表达呈阳性,证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。提示兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞具有较强的生长和增殖能力,可用于干细胞标记及进一步自体移植治疗。     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.目的:观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成.材料:C57BU6小鼠4～6周龄.体质量20g,雌雄不拘.方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞.参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%.用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块.然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10~6/cm~2浓度接种75 cm~2培养瓶.对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-Dil标记.主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度.结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形,多角形和扁平形.3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45.③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构.在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒.④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上.流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞.结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪.     

BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性.目的:以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成.材料:4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供.方法:密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增.取5×1010L-1个骨髓间充质干细胞接种于25 mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎生血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导.取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10 μmol/L BrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率.结果:分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代争明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍末见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Von kossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%.结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BndU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法.     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景:目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/4,牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少.目的:观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响.方法:用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定.结果与结论:脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖.流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变.     

体外培养羊骨髓来源间充质干细胞的生物学特性观察

背景:目前关于鼠、兔等小动物骨髓来源间充质干细胞的研究较多,但涉及大动物骨髓来源间充质干细胞的报道甚少.目的:体外培养羊骨髓来源间充质干细胞,并了解其生物学特性.方法:取健康10月龄中国山羊1只,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓5mL,采用全骨髓培养法接种于无菌塑料培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基.待细胞达80%-90%融合后,胰蛋白酶消化传代.取P3代处于对数生长期的细胞予以冻存,然后进行复苏.倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,Yon Kossa's染色检测成骨诱导分化潜能.结果与结论:原代培养羊骨髓来源间充质干细胞贴壁生长,呈梭形;P3代后细胞形态基本一致,均为长梭状;冻存复苏后细胞贴壁较传代细胞稍慢,细胞形念和活性与传代细胞没有明显差别.P3-P5代细胞生长周期基本一致,接种后两三天为生长迟滞期,3 d后进入对数生长期,六七天为生长平台期,其后牛长速度减缓.羊骨髓来源间充质干细胞成骨诱导3周后,Von Kossa's矿化结节染色呈阳性.证实所培养的羊骨髓来源间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力,可向成骨细胞定向分化.     

成人骨髓间充质干细胞培养条件优化及多向分化的能力

背景:成人骨髓中间充质干细胞数量少,要使其能够更好地应用于组织工程和细胞治疗,就必须建立成熟、简便、有效的分离培养扩增体系.目的:建立成人骨髓间充质干细胞最佳培养方法,并观察诱导其向成脂肪、成骨及软骨细胞分化结果.方法:分别采用密度梯度离心法和全骨髓培养法,分离培养成人骨髓间充质干细胞,通过光镜观察细胞形态,绘制生长曲线比较不同培养方法对骨髓间充质干细胞的影响;免疫荧光法鉴定表面抗原CD34、CD44和CD105的表达.不同诱导培养基诱导成人骨髓间充质干细胞,采用油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色检测成脂、成骨和成软骨诱导情况.结果与结论:全骨髓培获得的骨髓间充质干细胞,其增殖能力和生长特性明显优于密度梯度离心法;细胞表面抗原CD44、CD105强阳性,CD34阴性;经过诱导培养,油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色均为阳性,证明全骨髓培养法获得细胞具有更强的生长增殖能力,并具有向脂肪,骨和软骨等组织多向分化的潜能.     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景:要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节.目的:采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法.方法:通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞.经传代扩增,细胞进一步纯化.取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果.利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线.结果与结论:全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱.PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变.结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法.