丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。     

人Oct4与细胞穿膜肽融合蛋白的表达

目的通过原核表达获得人Oct4(hOct4)与细胞穿膜肽融合蛋白,优化其表达方法并观察其穿膜效果。方法通过基因工程手段构建了pET原核表达载体,利用BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)蛋白表达菌表达蛋白。Ni亲和纯化方法纯化蛋白,蛋白质印迹分析检测融合蛋白组成。将融合蛋白用罗丹明染色后加入人正常皮肤成纤维细胞株BJ观察其穿膜进入细胞情况。结果构建了pET21a(+)-hOct4-11R-His和pET21a(+)-EGFP-11R-His表达载体,转入大肠杆菌中后诱导获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,经蛋白质印迹分析检测表明融合蛋白正确。经BJ细胞测试,观察到融合蛋白进入细胞中。结论成功获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,且融合蛋白能够高效进入BJ细胞并聚集于细胞核周围。     

登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达

目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476 bp的原核表达载体并进行原核表达.方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50.结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml.结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用.     

人Delta-like4~(ext)-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测

目的:原核表达、纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217,并对其活性进行检测.方法:采用PCR方法扩增hDll4ext-93-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体,获得pET32a(+)-hDll4ext-93-217载体.以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达.以镍离子螯合柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达;采用萤光素酶报告基因系统检测目的蛋白活性.结果:通过PCR扩增获得了目的片段hDll4ext-93-217,成功构建了该蛋白的原核表达载体pET32a(+)-hDll4ext-93-217.采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217的表达.融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217在25℃,IPTG终浓度0.5mmol/L条件下诱导表达8h的蛋白表达量最高.以镍离子螯合柱纯化,获得纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217浓度为1.5g/L,其荧光素酶报告基因的刺激活性与空白对照...     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的扩增编码Ⅳ型菌毛蛋白的嗜肺军团菌pilE基因,构建重组质粒pET32a(+)-pilE并在原核系统中表达,纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE,为进一步探讨Ⅳ型菌毛蛋白的作用及其作为军团病的诊断抗原提供实验基础。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从嗜肺军团菌扩增得到pilE基因,构建重组质粒pET32a(+)-pilE,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用聚合酶链式反应、限制性酶切分析、序列分析鉴定后,IPTG诱导表达PILE蛋白,用硫酸十二烷酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹鉴定。使用HisTrapTMHP亲和层析柱纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。结果扩增出430bp的pilE基因;构建了重组质粒pET32a(+)-pilE;表达并纯化出35700Mr的目标蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的原核重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。成功纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

小鼠IL-4重组质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化

目的 构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并鉴定.方法 将优化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a (+)上,获得重组质粒pET32/rmIL-4,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体.经复性处理后,依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白.对纯化得到的蛋白用Western blot检验免疫学特异性,用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功.诱导得到的包涵体用3 mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7 mol/L盐酸胍溶液中变性,在pH9.5的条件下梯度透析复性.纯化出的蛋白经Western blot鉴定,能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合;经细胞和动物实验鉴定,rmIL-4蛋白具有生物学活性,能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖,使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4,为进一步研究其生物学功能提供了条件.     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达

目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量最大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.     

~1PEP-1-p27mt融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自pORF9-hp27mtv21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-TEasy Vector。经XhoI和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化EcoliBL21(DE3)pLysS,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白。结论:PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

Prokaryotic expression of recombinant human p75NTR-Fc fusion protein and its effect on the neurite outgrowth of dorsal root ganglia neuron

Objective： To clone, express, and identify the extracellular domain gene of human p75 neurotrophin receptor with IgG-Fe （hp75NTR-Fc） in prokaryotic expression system, and investigate the effect of the recombinant protein on dorsal root ganglia （DRG） neuron neurites. Methods： The hp75NTR-Fc coding sequence was amplified from pcDNA-hp75NTR-Fc by polymerase chain reaction （PCR） and subcloned into vector pET30a （＋）, in which hp75NTR-Fc expression was controlled under the T7 promoter. The recombinant vectors were amplified in E. coli DH5α and identified by PCR, enzyme digestion and sequencing, and then transformed into E. coli BL21 （DE3）. The expression product was analyzed with SDS-PAGE and Western blot. Then after the recombinant protein purified with Protein A affinity chromatograph, and renaturated with dialysis, respectively, the effect of the recombinant protein on DRG neuron neuritis was further investigated. Results： The results of PCR, enzyme digestion, and sequencing demonstrated the success of inserting the hp75NTR-Fc fragment into vector pET30a （＋）. SDS-PAGE and Western blot showed a positive protein band with molecular weight about 50 kD in the expression product, which is accordant with the interest protein, and this band could be specifically recognized by rabbit anti-NGFRp75 antibody. The purified infusion protein following dialysis could promote neurite outgrowth of DRG neurons cultured with myelin-associated glycoprotein （MAG）. Conclusion： The hp75NTR-Fc coding sequence was subcloned into the expression vector pET30a （＋） correctly and expressed successfully in the prokaryotie expression system. The infusion protein could promote neurite outgrowth of DRG neurons cultured with MAG.     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。