小窝蛋白-1敲减对人甲状腺上皮细胞趋化因子mRNA表达的影响

目的: 探讨小窝蛋白-1（Caveolin-1）RNA干扰慢病毒对人甲状腺上皮细胞Nthy-ori 3-1趋化因子mRNA表达的影响。方法: 采用分子克隆技术,根据Caveolin-1的短发夹RNA序列,构建pLKO.1-Caveolin-1重组质粒,将其或空载质粒与慢病毒包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染人胚肾上皮293T细胞。48 h后收集病毒液并感染Nthy-ori 3-1细胞,用嘌呤霉素筛选出阳性细胞,于倒置显微镜下观察Nthy-ori 3-1细胞的生长情况;荧光实时定量PCR和蛋白质印迹检测Caveolin-1的敲减效果;荧光实时定量PCR检测CXC趋化因子配体10（CXCL10）、CC趋化因子配体20（CCL20）mRNA表达水平。结果： 慢病毒感染后的Nthy-ori 3-1细胞生长状态良好,Caveolin-1的表达显著降低。抑制Nthy-ori 3-1细胞中Caveolin-1表达后,其CXCL10、CCL20的mRNA表达水平显著上调。 结论： 成功构建Caveolin-1 RNA干扰慢病毒,Caveolin-1可能通过影响某些趋化因子的表达,参与桥本甲状腺炎的发生。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中趋化因子及其受体CCR6 mRNA的表达及其临床意义

目的探讨原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中CC型趋化因子配体20（CCL20）和CC型趋化因子受体6（CCR6）mRNA的表达及临床意义。方法采用TaqMan荧光探针技术,建立实时荧光定量PCR的方法,分别检测50例PBC患者、50例乙型肝炎肝硬化患者及50例健康对照者PBMCs中CCL20和CCR6 mRNA的表达水平。结果 PBC患者中CCL20和CCR6的mRNA表达显著高于健康对照组和疾病对照组（P〈0.01）;并根据临床不同分期检测后发现,PBC患者中Ⅲ、Ⅳ期CCL20和CCR6 mRNA的表达较Ⅰ、Ⅱ期明显升高（P〈0.05）。结论 PBC患者CCL20和CCR6 mRNA的表达与PBC的发生发展存在一定的相关性,可能参与PBC的调控机制,从而可能为PBC的诊断和预防提供一定的线索。     

人RORγtm RNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的: 建立检测人RORγt(retinoid-related orphan receptor gammat) mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)方法.方法: 根据人RORγt mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)总RNA,并逆转录成cDNA,与pMD-18T载体连接构建质粒标准品.采用qRT-PCR方法检测RORγt mRNA水平,并评价该方法的线性、特异性及重复性.应用该方法检测Graves病(Graves′ disease, GD)患者外周血中RORγt mRNA的相对表达.结果:该方法标准曲线的相关系数为0.998,融解曲线分析显示单个峰,pMD18T-RORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%,8.4%和9.6%,11.2%.初步研究表明GD患者组RORγt mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-3.72, P<0.01).结论: 建立的检测人RORγt mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好,为临床应用提供了实验基础.     

CCL27 CCL28及 CCR10在癫痫小鼠急性期表达增高

目的：探讨趋化因子 CCL27、CCL28及其受体 CCR10在小鼠癫痫急性期外周血中的表达变化。方法取正常及癫痫小鼠急性期不同时间点(10 min、30 min、1 h、2 h)外周血利用实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)法检测毛果云香碱致癫痫发作小鼠急性期外周血中 CCL27、CCL28 mRNA 水平;同期取正常及癫痫急性期不同时间点(10 min、30 min、1 h、2 h)肝素抗凝外周血,提取淋巴细胞层后利用 FACSsort 型流式细胞仪检测外周血淋巴细胞 CCR10蛋白水平的表达变化。结果癫痫小鼠发作急性期外周血中 CCL27、CCL28 mRNA 水平、淋巴细胞中 CCR10蛋白表达水平均在癫痫发作2 h 高于对照组(P <0.05)。结论癫痫发作早期已出现外周血免疫功能紊乱,该病理变化可能与癫痫发病过程中的炎性反应和神经细胞的凋亡相关。     

实时荧光定量PCR检测人IL-9 mRNA方法的建立及应用

目的：建立检测人白介素-9（interleukin-9,IL-9）mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quantitative PCR,qRT—PCR）方法。方法：分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear ceils,PB—MC）,经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD-18T载体连接构建质粒标准品。采用qRT—PCR方法检测IL-9mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性,应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA表达水平。结果：建立了人IL-9的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r^2为0．995～0．998,熔解随线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组（P〈0．01）。结论：建立的检测人IL-9 mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好,为进一步临床应用提供了实验基础。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

定量检测CCL20的竞争性内参照RT-PCR的建立及其初步应用

目的　建立检测趋化因子CC亚家族配体2 0 (CCL2 0 )表达水平的内参照定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法。方法　将人CCL2 0编码基因克隆到pBs ΔANK质粒中(PAL 2 ) ,将一4 2bp的外源核苷酸片断插入到上述重组质粒的CCL2 0中间,构建内参照质粒PAL- 2 - IS。在该定量系统中以PAL- 2 -IS和PAL- 2为模板,用CCL2 0的特异性引物扩增,根据扩增出的两个不同大小的条带的光密度扫描值对CCL2 0进行相对定量。结果　将PAL -2与已知不同系列浓度的PAL- 2 - IS以内参照竞争定量RT- PCR共扩增定量PAL- 2浓度,PAL- 2计算浓度与实际浓度无差异(P >0 .0 5 )。在同一细胞数量水平(10 5数量级) ,内参照竞争定量RT- PCR检测表明:CCL2 0在L0 2、HepG2、Hepal、Hepa3中表达水平高于Hepa2 ,而在HepG2 .2 .15中最低。结论　建立了检测CCL2 0表达水平的内参照定量RT -PCR方法,该方法可用于细胞中CCL2 0不同表达水平的检测。     

趋化因子CXCL1在肥胖小鼠脂肪组织中的表达及意义

目的探讨趋化因子CXCL1在肥胖小鼠脂肪组织中的表达及意义。方法将20只小鼠随机分为高脂饲料喂养组和普通饲料喂养组,每组10只,分别给予高脂饲料和普通饲料喂养。提取2组小鼠附睾脂肪组织总RNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测小鼠附睾脂肪组织中CXCL1 mRNA表达水平;成脂诱导脂肪间充质干细胞,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中CXCL1的表达。结果与普通饲料喂养组小鼠比较,高脂饲料喂养组小鼠附睾脂肪组织中CXCL1 mRNA表达显著增加(P=0.001);CXCL1蛋白表达水平随脂肪细胞分化时间延长而逐渐增加。结论小鼠肥胖状态下CXCL1表达明显增加,推测CXCL1在肥胖的发生发展过程中发挥重要作用。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达

目的 建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法,检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异.方法通过实时荧光PCR,选择合适的"相对标准品"绘制相对标准曲线,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平.结果相对标准曲线有较好的线性(r=0.999及0.984);实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升.结论双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠;传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平.     

实时RT-PCR定量检测NGF mRNA表达水平方法的建立

目的:建立一种用SYBR GreenⅠ实时定量逆转录(SYBR GreenⅠQ-RT-PCR)检测大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)mRNA基因表达的方法。方法:以Trizol一步法提取大鼠脑组织总RNA,以Oligo(dt)18为引物逆转录产生cDNA,利用SYBRGreenⅠ荧光染料法实时检测NGF mRNA的表达水平。通过熔解曲线分析NGF mRNA检测的特异性,以管家基因β-actin为内参照对NGF进行定量分析。结果:建立的大鼠NGF mRNA SYBR GreenⅠ实时检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立实时RT-PCR检测NGF mRNA基因表达的方法。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ,建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应,在每反应10^0～10^7拷贝范围内,CT值（C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒基因方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光PCR快速检测登革热病毒的方法。方法以通用引物对标准株提取物和血清样本进行RT—PCR扩增，同时以SYBR Green I标记进行实时PCR扩增，分析其灵敏性特异性和重复性。结果标准毒株的扩增结果与预期结果相同，测序结果显示实验结果序列与标准株序列一致。实验的灵敏性特异性和重复都较高。结论SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒的方法是一个快速、准确检测登革热的方法，但它更适用于早期传染病监测。     

SYBR Green 实时荧光定量 PCR 法检测人乳腺球蛋白在乳腺癌诊断中的应用?

目的：探讨 SYBR Greens 实时荧光定量 PCR 法在乳腺癌诊断中的应用价值。方法以β-actin 为内对照,采用荧光定量 PCR(FQ-PCR)法检测45例健康女性体检者、91例良性乳腺疾病、193例乳腺癌以及87例其他肿瘤患者外周血中人乳腺球蛋白(human mammaglobin,HMAM)的表达量,分析其在不同临床病理因素情况下基因表达量的差异,并与 RT-PCR 法及其他乳腺癌标志物(CEA、CA125和 TSGF)进行灵敏度和特异性的比较。结果乳腺癌患者 HMAM 阳性率明显高于健康体检者、良性乳腺疾病和其他肿瘤患者(P <0.05);良性乳腺疾病和其他肿瘤患者 HMAM 阳性率高于健康体检者(P <0.05);良性乳腺疾病和其他肿瘤患者 HMAM 阳性率比较,差异无统计学意义(P >0.05)。乳腺癌患者 HMAM 表达与年龄、肿瘤大小、乳腺癌类型及雌激素受体、孕激素受体表达无关(P >0.05),与乳腺癌临床分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移及 HER2/neu 表达呈正相关(P <0.05)。HMAM 对乳腺癌诊断的灵敏度高于 TSGF 和 CEA(P <0.05),特异性高于 CA153、TSGF 和 CEA(P <0.05)。SYBR Green FQ-PCR 对乳腺癌检测的灵敏度和特异性均高于 RT-PCR(P <0.05)。结论SYBR Green FQ-PCR法检测 HMAM 灵敏度高、特异性强,可有效辅助乳腺癌的诊断。     

溃疡性结肠炎中B细胞对巨噬细胞趋化作用的初步研究

目的 观察B细胞与巨噬细胞在溃疡性结肠炎疾病进展过程中在结肠组织中的浸润比例变化,探讨两种细胞间趋化作用机制.方法 使用经典氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(azoxy-methane/dextran sodium sulfate,AOM/DSS)小鼠溃疡性结肠炎癌变模型作为研究对象,分别获取不同疾病阶段小鼠外周血及结肠组织...     

CC趋化因子配体20在肝细胞癌组织中的表达及其在肝细胞肝癌预后评估中作用的生物信息学分析

目的:研究CC趋化因子配体20 (CCL20)在肝细胞肝癌(LIHC)组织中的表达,并探讨其对LIHC患者预后的影响,阐述CCL20影响LIHC恶性行为的机制。方法:采用Rstudio (4.03)软件从癌症基因图谱(TCGA)和UCSC Xena平台获取LIHC患者癌组织和癌旁组织中CCL20 mRNA表达水平和临床数据,比较CCL20 mRNA在2种组织中的表达差异,并利用GEPIA联合GTEx数据对上述结果进行验证;采用Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析法分析CCL20 mRNA表达水平与LIHC患者预后的关系。通过Pearson相关分析对LIHC患者CCL20 mRNA表达水平与甲胎蛋白(AFP)水平的相关性进行分析,并通过受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)、诺谟图和校正曲线分析LIHC患者CCL20 mRNA表达水平与患者临床诊断和生存预测情况的相关性。采用TCGA数据库对LIHC患者癌组织中CCL20 mRNA的表达进行基因集富集分析(GSEA),分析CCL20 mRNA表达水平与DNA拷贝数突变和DNA甲基化水平的相关性。结果:与癌旁组织比较,LI...     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。     

SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响

目的 建立SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测HBV-DNA方法,并检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响.方法 提取HepG2.2.15细胞DNA,PCR扩增后纯化,PCR纯化产物梯度稀释作为标准品,采用SYBR Green Ⅰ Real-time PCR 检测,建立标准曲线,并分析方法的特异性、灵敏度、重复性和稳定性.运用建立的SYBR Green Ⅰ 方法检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响,并与Taqman方法进行比较.结果 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法特异性、重复性及稳定性均较好,线性范围为107~102copies,检测灵敏度可达102copies.IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA具有抑制效果,且呈剂量依赖性.SYBR Green Ⅰ 方法与Taqman商业试剂盒检测结果差异无统计学意义.结论 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法简便快速、结果准确、价格低廉,可以满足HBV-DNA拷贝数检测的需要.