丹参EST序列中SSR信息的分析及分子标记的建立

本文对从NCBI下载的鼠尾草属11747条EST序列（其中,丹参10228条）进行分析,搜索到含SSR的序列1911条,共含有SSR 2156个,出现频率为18.35%。在丹参EST-SSR中,核苷酸重复基元种类共77种。单核苷酸重复最多,出现频率为10.45%,二、三核苷酸的出现频率为3.72%、4.40%。三核苷酸重复中ACG/CTG为主要类型,占27.3%。共设计引物143对,合成13对（其中,丹参6对,Salvia fruticosa7对）,在对引物、dNTP、MgCl2进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。引物筛选发现7对引物（丹参6对,S.fruticosa 1对）对丹参基因组DNA均有良好的扩增,并对11个不同产地丹参样品进行扩增均呈现良好的多态性。本研究结果证明根据丹参EST资源建立丹参EST-SSR标记是可行的。     

丹参EST序列中SSR信息的分析及分子标记的建立

本文对从NCBI下栽的鼠尾草属11747条EST序列（其中,丹参10228条）进行分析,搜索到含SSR的序列1911条,共合有SSR2156个,出现频率为18．35％。在丹参EST—SSR中,核苷酸重复基元种类共77种。单核苷酸重复最多,出现频率为10．45％,二、三核苷酸的出现频率为3．72％、4．40％。三核苷酸重复中ACG／CTG为主要类型,占27．3％。共设计引物143对,合成13对（其中,丹参6对,Salvia fruticosa7对）,在对引物、dNTP、MgCl2进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。引物筛选发现7对引物（丹参6对,S．fruticosa 1对）对丹参基因组DNA均有良好的扩增,并对11个不同产地丹参样品进行扩增均呈现良好的多态性。本研究结果证明根据丹参EST资源建立丹参EST—SSR标记是可行的。     

蛭类转录组中EST-SSR分析及抗凝血相关分子标记的挖掘

目的对蛭类转录组进行SSR分析,是开发功能分子标记、开展对药用蛭类资源的开发利用及进行遗传背景监测的必要手段。方法利用与医学密切相关的医蛭科棒纹牛蛭Poecilobdella javanica和日本医蛭Hirudo nipponia、黄蛭科宽体金线蛭Whitmania pigra和山蛭科洞穴山蛭Heamadipsa cavatuses sp.nov.共14个样本,通过RNA测序及转录组分析,筛选吸血差异unigene,并比较4个种的SSR标记特征和分布,用于挖掘抗凝血相关功能EST-SSR。结果通过SSR密度分析发现,SSR在棒纹牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭和洞穴山蛭转录组中的间隔长度为4 723、6 026、8 059、8 144 bp;SSR组成分析发现三碱基重复的基序占蛭类SSR类型组成中绝大多数;另外,洞穴山蛭的SSR组成与其他3种存在明显区别。比较4种吸血蛭吸血前后转录组中表达丰度显著差异的unigene群,发现4种蛭中包含SSR且抗凝血相关的重叠unigene类群在转录组中呈较高的片段多态性。结论 unigene片段长度、SSR的密度、组成和分布特点能反映物种之间的分类关系;4种蛭重叠的抗凝血相关分子功能对应的EST-SSR,可作为抗凝血相关的功能分子标记侯选EST-SSR。     

DNA分子标记在丹参药材质量控制中的应用

本文主要介绍了随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、相关序列扩增多态性(SRAP)、基于表达序列标签(EST)所建立的简单重复序列标记(SSR)、DNA序列测定技术等分子标记技术在丹参种内遗传多样性、物种演化及其与地理分布关系。分析表明,不同分子标记各有优缺点,建议将多种分子标记相结合或与传统的形态学标记、生物化学标记和细胞学标记相结合,从而为丹参种质资源的收集保存、分类鉴定、药材质量控制、合理开发利用与品种选育等提供理论依据。     

轮叶党参EST-SSR标记的开发及在党参属中的应用

目的开发EST-SSR标记,分析其在党参属及近缘属种间的通用性。方法利用MISA软件对轮叶党参在NCBI公布的EST序列进行SSR位点查找,Primer 3.0软件设计引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,聚丙烯酰胺凝胶电泳对所筛选的引物进行多态性检测。结果共查找到204个EST-SSR位点,总长5 263 bp,平均长度25.80 bp,出现频率为22.97%,其中单核苷酸、二核苷酸和六核苷酸重复占比最多,分别为36.8%、24.8%和15.3%。单核苷酸、二核苷酸、六核苷酸中的主要重复基元类型是A、TG和CAGCTC/GTGGCA。共设计引物112对,以党参为模板,能够扩增出清晰稳定条带的引物有67对,有效引物比率59.82%,其中27对能扩增出多态性条带,多态引物比率24.11%。随机选取5对引物对党参属及桔梗共12份材料进行PCR扩增,聚类结果将党参属和桔梗属分为2大类。结论研究筛选出的EST-SSR标记能够在党参属及近缘属内进行区分鉴别,研究结果为党参种质鉴别、遗传多样性分析及资源的评价利用等提供了重要技术手段。     

EST-SSR标记对三七选育品系的研究

目的:通过对不同三七选育品系的遗传变异和遗传分化程度进行分析比较,为三七的品种选育提供理论依据.方法:利用自行设计和他人开发的17对EST-SSR引物,对来自4个不同区域的17份三七选育品系进行遗传多样性及遗传分化分析.结果:在17份三七选育品系中一共扩增出136个多态位点,平均多态信息量PIC值为0.78,Nei's基因多样性H0.139,Shannon多样性指数I0.208.选育品系间的遗传分化系数为0.382,遗传相似度和聚类分析的结果表明17份三七选育品系和屏边三七被划分为4个大类群,其中17份三七选育品系被分为3个类群,屏边三七单独在一个类群.结论:通过集团选择后,从相同栽培居群内筛选出的不同品系存在一定程度的遗传分化,可以用EST-SSR标记来检测集团选择的结果.     

多花黄精转录组SSR位点分析及分子标记开发

目的基于转录组测序数据鉴别和分析多花黄精EST-SSR位点,开发可用于多花黄精种质资源评价与利用的SSR标记。方法利用MISA工具从多花黄精转录组126 544条Unigenes中鉴定SSR位点并进行分析;利用Primer 3.0设计SSR引物,随机选择50对SSR引物进行有效性验证。结果从9 982条Unigenes中鉴定出12 317个包含2～6个核苷酸重复类型的SSR位点,SSR的分布频率为9.73%,发生频率为1/5.91 kb;SSR位点中的主导类型是二核苷酸重复,占总SSR的53.14%,其次是三核苷酸重复,占33.31%。SSR引物的有效性筛选显示,50个SSR引物对中有29个(58%)可从多花黄精中扩增出预期大小的SSR条带。SSR荧光标记的毛细管电泳检测显示在多花黄精的7个SSR位点共鉴定出了9种基因型,进一步验证了SSR引物的有效性。结论多花黄精转录组SSR位点出现频率高,重复类型丰富,多态性较高,这将为多花黄精遗传多样性分析和遗传图谱构建提供大量有价值的候选标记,也可为黄精属内种间物种的分子鉴别、多花黄精优良品种的分子辅助育种提供技术手段。     

虫草属EST-SSR标记系统的建立研究

目的:通过球孢虫草、蛹虫草EST设计EST-SSR引物,建立虫草属EST-SSR标记系统.方法:从NCBI公共数据库下载获得虫草EST,利用Sequece Seiners 1.2软件去除冗余序列并设计引物,进行PAGE电泳.结果:通过去除EST总序列中低质量的和冗余的序列后,得到全长为2 953 173 bp的4 556条无冗余球孢虫草EST.从中发掘出718个EST-SSR,分布于616条EST中,出现频率是15.8％.平均分布频率是每4 096 bp出现1个,三核苷酸重复序列有419个,是出现最多的重复类型.蛹虫草EST去冗余后得到1 363条无冗余EST,共含有1 117个EST-SSR,出现频率为81.95％,出现最多的重复类型是A核苷酸重复.根据球孢虫草EST-SSR序列,设计合成50对引物,有扩增产物的引物为34对,占总设计引物数的68％.根据蛹虫草EST-SSR,设计合成40对引物,有扩增产物的引物为39对,占总设计引物数的97.5％.基于SSR标记进行聚类分析,7种虫草无性型均能分开,且分为4支.结论:虫草属EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值.球孢虫草和蛹虫草EST开发的SSR标记在虫草属有较好的转移性与通用性,可以很好的应用于虫草种间遗传关系的研究.应用虫草物种EST建立分子标记是一条简便而又有效的途径.     

川芎转录组SSR分析与EST-SSR标记的开发

该研究通过组装川芎根转录组数据获得24 422个unigene,随后对得到的unigene进行了SSR检测,共检测到4 073个SSR位点。对检测到的EST-SSR进行特征分析,结果显示单核苷酸重复最多,占41.0%。SSR所在序列功能注释结果显示在Nr中有2 201条序列能够被注释,同时SSR所在序列还被注释到49个GO分类和242个KEGG代谢通路中。利用SSR检测结果进行了EST-SSR标记开发,合成其中235对引物进行验证,74对扩增效果较好。利用74对EST-SSR引物对34个川芎资源进行遗传多样性分析,结果显示收集的川芎资源多样性较好,UPGMA聚类显示川芎资源分为两大类,聚类结果表现出一定的地域性,PCo A分析与UPGMA聚类结果类似。该研究首次对川芎进行EST-SSR分析和标记开发,对推动川芎资源遗传多样性研究、品种纯度检测、基因定位和分子育种等具有重要意义。     

广西莪术EST-SSR标记开发

目的利用NCBI公布的姜黄EST序列,挖掘SSR位点,开发近缘种广西莪术EST-SSR标记。方法下载NCBI公布的姜黄EST序列,利用SSR-FINDER搜索SSR位点,采用Primer5.0设计SSR引物,挑选30个表现型差异较大的广西莪术进行有效性及多态性检测。结果 12 678条EST序列含有SSR位点1 243个,其中二核苷酸、三核苷酸重复序列最多,分别占50.36%,31.54%,以AT/TA和CT/GA出现频率最高。利用Primer5.0设计引物共325对,PCR检测表明,104对引物可以扩增出稳定清晰的带型;在至少30份不同种质广西莪术中检测到48对SSR引物具有多态性,占设计引物的38.09%。结论姜黄EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR标记开发效率较高。     

丹参分支酸变位酶基因的克隆和生物信息学分析

应用BlastX检索丹参毛状根的EST数据库,发现1条与分支酸变位酶(chorismate mutase,CM)高度同源的序列,克隆得到其全长cDNA,命名为SmCM1,Genbank登录号为KC784342.SmCM1全长948 bp,理论pI 6.41,与矮牵牛Petunia×hybriida、拟南芥Arabidopsis thaliana和毛果杨Populus trichocarpa的CM1分别具有70％,72％,64％的相似性.实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,QRT-PCR)分析表明SmCM1在丹参叶中的含量较高,其次是茎,在根中的含量相对较低.酵母诱导子(YE)和离子(Ag+)联合诱导丹参毛状根后,SmCM1与莽草酸途径的关键酶3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶(3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase,DAHPS)和分支酸合酶(chorismate synthase,CS)基因表达趋势呈协同变化.YE+ Ag+处理后3个基因皆上调表达,8h达到表达高峰,分别是对照的7.9,5.5,9.8倍,随后下调,36 h时下降至对照水平以下,说明诱导处理之后糖代谢中间产物经莽草酸和分支酸途径合成苯丙氨酸和酪氨酸从而引起酚酸类化合物的过量积累.     

丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析

目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎,在叶和花中有微量表达;茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.     

丹参抗肿瘤活性成分研究新进展

丹参中含有多种抗肿瘤活性成分,在水溶性成分中主要有丹酚酸A,丹酚酸B,salvinal等,在脂溶性成分中主要有丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A、二氢丹参酮Ⅰ、次丹参酮、隐丹参酮、凤眼草内酯、新丹参内酯、含氮化合物等.这些抗肿瘤活性成分在肿瘤发生发展及转移的不同阶段,起着重要作用.丹参中新的抗肿瘤活性成分的发现,对丹参的抗肿瘤临床应用具有推动作用.     

丹参ERF转录因子SmERF1基因的表达分析和亚细胞定位

目的:对前期已经克隆的丹参SmERF1基因进行聚类分析,分析SmERFI基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况;并对其进行亚细胞定位分析.方法:利用MEGA5软件对SmERF1基因及拟南芥ERF基因家族进行聚类分析;利用半定量RT-PCR方法,分析SmERF1基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况;将SmERF1与GFP融合,在洋葱表皮瞬时表达,以确定SmERF1蛋白表达部位.结果:丹参SmERF1属于ERF家族第Ⅶ亚族;YE+ Ag+诱导对SmERF1基因的表达没有影响,ABA和MeJA可以抑制该基因的表达,而水杨酸诱导会出现先抑制,后随处理时间加长,SmERF1基因表达又恢复;亚细胞定位确定SmERFI基因在细胞核内特异表达.结论:SmE RF是一个AP2/ERF转录因子,属于AP2/ERF家族第Ⅶ亚族,其表达受ABA,SA,MeJA等激素调节控制.     

丹参枯萎病及其病原菌的研究

丹参是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物,栽培丹参枯萎病发生严重,严重影响栽培丹参产量和质量。针对上述问题,采用形态学和病原学实验手段对从发生枯萎病丹参植株茎和根中分离得到的病原菌进行鉴定,同时根据ITS序列采用PCR的方法进行进一步确定。结果表明丹参枯萎病多发生7—8月高温、多雨季节,栽培一年丹参枯萎病的发生率为10%左右,而栽培三年或者三茬丹参枯萎病的发生率达到了60%~70%。枯萎病会引起丹参根腐,因此生产上易误认为根腐病。形态学鉴定结果表明该病原菌为尖孢镰刀菌,ITS序列也表明其与黄瓜枯萎病菌的ITS序列同源性为99%。因此,作者认为引起丹参枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。     

川产丹参炒制工艺优选及其质量标准

目的:对川产丹参炒制工艺进行优选并建立其质量标准.方法:通过L9(34)正交设计,以丹参中有效成分原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量为指标,对川产丹参的炒制工艺进行优选;依据2010年版《中国药典》下质量标准对各指标进行检测.结果:温度和时间对丹参炒制均有显著影响,70 ～ 80℃炒制温度影响最大,炒制5min影响最大.结论:炒丹参最佳工艺为炒制温度70～80℃,炒制时间5 min,炒丹参质量标准合理、可行.     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化

目的:在前期克隆丹参SmJAZ1基因的cDNA全长基础上,为研究丹参SmJAZ蛋白的功能,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达丹参SmJAZ1蛋白,并对其表达条件进行优化.方法:利用分子克隆的方法将丹参JAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行诱导表达.结果:对影响重组蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、及IPTG添加时间进行优化,确定丹参SmJAZ1重组蛋白最适表达条件.IPTG浓度对目的蛋白的表达量没有显著影响;随诱导时间和诱导温度增加,SmJAZ蛋白的表达量增加;而IPTG添加时间对蛋白的表达量有明显影响.结论:丹参JAZ1蛋白在30℃温度条件下,重组菌生长2 h(A600 =0.9),加入0.1 mmol·L-1浓度的IPTG,诱导20 h后,表达条件最合适.     

丹参多糖的组成分析

目的:了解丹参多糖种类和相对分子质量的分布情况。方法:通过高效凝胶渗透色谱技术,分析了丹参多糖相对分子质量的分布情况。结果:丹参多糖按照相对分子质量分布,明显分成两部分。结论:丹参多糖低相对分子质量部分是一个纯度很高的多糖,具有一定的开发价值。     

丛枝菌根真菌与哈茨木霉菌合用对连作丹参生长及质量的影响

该文探讨田间条件下丛枝菌根真菌(AMF)与哈茨木霉菌合用对丹参生长及质量的影响。采用田间小区试验来进行研究,使用HPLC测定丹参地上部分和地下部分有效成分含量,通过形态观察并计算根部发病率,并结合方差统计学方法对各指标的测定结果进行分析。结果显示,单独接种AMF以及AMF与哈茨木霉菌合用能够有效的降低连作丹参根部病害的发生率,其中AMF与哈茨木霉菌合用效果更佳,比CK组降低了61.50%。几种处理对丹参生物量影响没有显著差异,但都能提高丹参根部各种有效成分的含量。单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉都能显著提高丹参根中丹酚酸B的含量(P<0.05),其中AMF对丹酚酸B促进作用最明显,提高了27.97%;接种AMF能显著提高丹参根丹参酮I和丹参酮ⅡA的含量(P<0.05),其中丹参酮I约提高了70.14%;丹参酮ⅡA约提高了51.42%。另外,单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉均能显著提高丹参根中隐丹参酮的含量,提高了约30.67%。从而得出单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉能够有效减低连作丹参病害的发生率,同时提高连作丹参药材的质量。