脱氧氟尿苷增强顺铂对人肝癌BEL-7402细胞株的增殖抑制作用

目的 探讨脱氧氟尿苷（5-DFUR）和顺铂（CDDP）联合应用对人肝癌细胞系BEL-7402的增殖抑制作用。方法 采用克隆形成法检测细胞的增殖抑制率、流式细胞术检测细胞周期的改变及凋亡率。结果 5-DFUR（7.815～250mg/L）和CDDP（0.63～20mg/L）单独应用均对人肝癌BEL- 7402细胞有抑制作用，呈现剂量效应关系。5-DFUR与CDDP联合应用对人肝癌细胞BEL-7402产生显著的协同杀伤作用，5-DFUR与CDDP浓度接近IC50时即5-DFUR 62.5mg/L与CDDP 2.5mg/L联合用药时可使CDDP的抑制率从单独用药的45.12%提高到联合用药的89%（P〈0.01）。CDDP、5-DFUR单独应用48h后可诱导人肝癌BEL-7402细胞发生凋亡，凋亡比率分别为15.37%和21.25%，联合用药组在48h细胞凋亡的比率则为19.37%，72h后CDDP、5-DFUR单独应用诱导人肝癌BEL-7402细胞发生凋亡的比率分别为19.3%和28.37%，而联合应用组诱导凋亡细胞的比例达到55.7%（P〈0.01），CDDP与5-DFUR单用72h时，细胞周期G1期阻滞较为明显，而当5-DFUR与CDDP合用后，G1期、S、G2期/M期细胞增加，尤其是G2期/M期细胞数增加明显。结论 5-DFUR与CDDP联合应用对人肝癌细胞BEL-7402可产生显著的协同杀伤作用，其细胞周期调节发生在G2～M期，细胞被阻滞于G2～M期。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对肝癌细胞蛋白质差异表达谱的影响

目的 观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂-曲古抑菌素A(TSA)对肝癌细胞(BEL-7402)蛋白质表达谱的影响.方法 采用150 g/LTSA处理BEL-7402细胞16hr为试验组,未处理的细胞为对照组,分别抽提其总蛋白质,蛋白定量恒定为200 mg.经第一向固相pH梯度等电聚焦电泳和第二向垂直平板SDS-PAGE,凝胶银染后获得二维凝胶图并扫描输入计算机进行软件分析.将三次重复实验所获得的二维凝胶图进行统计学分析.将差异表达的蛋白质斑点从银染后的二维凝胶中切下,进行质谱分析.结果 实验组BEL-7402细胞90%～95%的蛋白质表达与对照组一致,5%～10%的蛋白质为差异表达;通过质谱对差异点的鉴定,获得了16个差异表达蛋白质,包括:Triosephosphate isomerase、47-KDa heat shock protein、TRAF1,5(up)、annexin A1、Heat shock70 protein、prohibitin、thioredoxin peroxidase、DP-1等分子,这些蛋白质涉及基因表达调控、信号转导、细胞代谢、抑制细胞增殖等众多分子事件.结论 TSA能够通过影响蛋白质的差异表达影响BEL-7402肝癌细胞的生长和增殖.     

转染TSLC1基因肝癌细胞株BEL-7402生物学特性的研究

目的 将人TSLCl基因转染人肝癌细胞BEL-7402中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 用脂质体法将TSLCl基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/TSLCl导人人肝癌细胞株BEL-7402中,G418筛选克隆,再以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot的方法检测TSLCI的表达,细胞计数、流式细胞术及裸鼠负荷瘤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 TSLCl在BEL-7402细胞中的表达可抑制BEL-7402细胞的生长,BEL-7402-TSLCI与BEL-7402比较s期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加.转染后的BEL-7402-TSLCl细胞的凋亡明显增加,转染后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论 TSLCl基因的转染可以抑制BEL-7402细胞的增殖、诱导肝癌细胞的凋亡,为肝癌的基因治疗提供理论依据.     

靶向Polo-like kinase 1基因的shRNA对肝癌BEL-7402细胞株生物学行为的影响

目的利用RNA（RNAi）干扰技术,研究表达Polo-like kinase 1（Plk1）的短发夹RNA（shR-NA）载体对肝癌细胞株BEL-7402生物学行为的影响。方法根据靶基因的不同区域构建针对Plk1mRNA的两组干扰质粒shRNA-Plk1：Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396以及阴性对照质粒Plk1siRNA-hk,利用电穿孔法转染入肝癌细胞株BEL-7402,获得稳定表达的克隆后,RT-PCR检测肝癌细胞株BEL-7402的Plk1mRNA的变化,Western blot检测Plk1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果利用电穿孔将载体转入肝癌细胞株BEL-7402,利用G418筛选,获得稳定表达的克隆。RT-PCR检测Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396组Plk1mRNA表达较Plk1siRNA-hk转染组与空白对照组明显下降（P〈0.01）。Western blot检测转染BEL-7402细胞shRNA载体后的Plk1蛋白的表达分别为0.032±0.007、0.040±0.008、0.272±0.041、0.278±0.053。MTT检测发现转染shRNA载体后BEL-7402细胞增殖明显减慢。细胞周期检测证实转染Plk1siRNA可以引起BEL-7402细胞G0/G1期减少,G2/M期增高,而对S期影响不大。结论成功构建出两条能特异而高效抑制Plk1基因表达的shRNA,可以显著抑制Plk1 mRNA的转录及Plk1蛋白的表达,并明显抑制细胞增殖,从而为肝癌的基因治疗提供新的切入点。     

TSA抑制人胰腺癌PANC1细胞生长的实验研究

目的研究去乙酰化转移酶抑制剂TSA对人胰腺癌PANC-1细胞生长的影响及其作用机制。方法用不同浓度的TSA处理PANC-1细胞。MTT法检测肿瘤细胞的增殖;流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期;Western免疫印迹及荧光定量RT-PCR分析抗凋亡基因bcl-2和肿瘤抑制基因p21WAF1/CIP1的表达。结果TSA作用于PANC-1细胞能明显抑制细胞的增殖,且具有明显的剂量依赖性;TSA处理72 h的PANC-1细胞其早期凋亡率明显提高(P0.05),G0/G1期细胞比例显著升高(P0.05),S期细胞比例显著降低(P0.05)。TSA在转录和翻译水平上能明显下调bcl-2的表达(P0.05),上调p21WAF1/CIP1的表达(P0.05)。结论TSA可以通过诱导胰腺癌细胞的凋亡和周期阻滞而抑制癌细胞生长;其发生机制可能与下调抗凋亡基因bcl-2和上调肿瘤抑制基因p21WAF1/CIP1的表达有关。     

曲古菌素A在胃腺癌细胞系SGC-7901中的作用

目的研究曲古菌素A（TSA）在胃腺癌细胞系SGC-7901中的作用。方法四甲基偶氮唑蓝法测定TSA对SGC-7901的细胞毒性，荧光显微镜观察细胞核DNA的变化，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，Western印迹检测组蛋白H3的乙酰化状态。结果SGC-7901细胞生长曲线表明，TSA浓度增高，细胞生长率下降。细胞凋亡率在75ng／mlTSA作用72h时与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。凋亡细胞DNA变化主要表现为核染色质固缩及断裂，荧光染色增强。流式细胞仪分析出现明显的亚G1期峰，G1期细胞减少，细胞凋亡率达29．54％。TSA作用后，乙酰化的组蛋白如明显增多。结论TSA可以诱导SGC-7901细胞发生凋亡，组蛋白H3的乙酰化状态可能与细胞凋亡有关。     

低浓度5-Fu24-小时持续化疗对BEL-7402肝癌细胞株的细胞周期的影响

目的研究低浓度5-Fu 24-小时持续化疗和高浓度5-Fu短时间化疗对BEL-7402肝癌细胞株的细胞周期的影响：方法用低浓度(1000．0μg/L)的5．Fu对BEL-7402肝癌细胞株进行持续24小时的培养(A组)，用高浓度(50000．0μg/L)的5-Fu对BEL-1 7402肝癌细胞株进行2小时培养(B组)，在培养后的不同时间点用流式细胞技术检测细胞周期的变化。结果A组结果显示：0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h的S期细胞的百分数分别为25.23％、32．35％、39．28％、41．05％、46．02％、47．00％及47．14％。B组结果显示：0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h的S期细胞的百分数分别为24．68％、68．43％、46．67％、43．67％、35．42％、33．22％及32．96％。结论5-Fu引起的S期细胞周期阻滞不但和浓度相关，也和作用时间相关。低浓度(1000．0μg/L)的5-Fu持续化疗较高浓度(50000．0μg/L)的5-Fu短时间(2小时)化疗更容易引起BEL-7402肝癌细胞株S期阻滞。     

拓扑替康对人肝癌BEL-7402细胞体外迁移、黏附的影响

目的 研究拓扑替康（topotecan,TPT）对人肝癌BEL-7402细胞体外迁移、黏附的影响.方法 体外培养人肝癌BEL-7402细胞,分为实验组和空白组,实验组分为三个亚组,分别用0.1、0.2、0.3 mmol/L的TPT进行干预,空白组给予不合TPT的培养液.采用划痕实验和Transwell小室迁移实验检测TPT对BEL-7402细胞体外迁移能力的影响,采用黏附实验检测TPT对BEL-7402细胞黏附和异质黏附能力的影响.结果 0.2、0.3 mmol/L TPT组中BEL-7402细胞的体外迁移能力受到抑制,同质黏附能力增强,而异质黏附能力减弱,差异具有统计学意义（P均＜ 0.05）.结论 拓扑替康可抑制肝癌BEL-7402细胞的迁移和异质黏附能力,增强肝癌细胞的同质黏附能力.     

HGF甲基化寡核苷酸对肝癌细胞系BEL-7402作用的研究

目的:肝细胞生长因子(HGF)能促进肿瘤生长,转移及血管形成,利用甲基化灭活基因的原理,探讨HGF启动子甲基化寡核苷酸对肝癌细胞系BEL-7402的作用.方法:分别用甲基化寡核苷酸、非甲基化寡核苷酸、PBS处理BEL-7402细胞,MTT检测肿瘤抑制率,RT-PCR检测HGFmRNA表达状况,流式细胞仪观察细胞凋亡率.结果:当甲基化寡核苷酸4μM、6μM、8μM、10μM时,肿瘤抑制率分别为47%、50%、64%、75%.RT-PCR显示其最早在8h发挥作用,维持72h.甲基化寡核苷酸处理组的细胞凋亡率显著高于其它各组(χ2=94,P<0.01).结论:HGF甲基化寡核苷酸能够抑制肝癌细胞BEL-7402的生长.     

组织蛋白酶S表达降低致肝癌细胞凋亡的机制研究

目的:探讨组织蛋白酶S(Cathepsin S,Cat S)表达降低后对肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法:选择2种肝癌细胞系MHCC97-H、Bel-7402,将肝癌细胞分为对照组、Con sh RNA组、Cat S sh RNA组。慢病毒介导的Cat S sh RNA转染肝癌细胞48 h后,Western blot检测Cat S表达变化;Annexin V/PI双染流式测细胞凋亡;Western blot检测内源性凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达变化;Western blot检测外源性凋亡相关蛋白Fas、Fas-L表达变化。结果:在肝癌细胞MHCC97-H、Bel-7402中,Cat S sh RNA可显著降低肝癌细胞中Cat S表达(P0.01);Cat S表达降低后,凋亡细胞显著增多(P0.01);内源性促凋亡蛋白Bax表达升高(P0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P0.01);外源性促凋亡蛋白Fas-L表达明显增强(P0.01),Fas表达无明显变化(P0.05)。结论:Cat S可同时通过内源性及外源性凋亡途径对肝癌细胞的凋亡进行调控。     

曲古菌素A对结肠癌Lovo细胞增殖抑制的研究

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A（TSA）对结肠癌Lovo细胞增殖活性的抑制作用。方法:采用不同浓度的TSA处理结肠癌Lovo细胞。MTT法检测药物作用前后的细胞增殖情况。流式细胞仪检测TSA处理前后细胞周期的变化。结果:TSA在500ng/mL浓度以上才能明显抑制结肠癌Lovo细胞的增殖，抑制率由第2天至第5天显著增加（57.21%至82.76%）细胞周期检测发现20ng/mL TSA即可导致细胞G1期阻滞，但没有诱导明显的细胞凋亡;≥100ng/mL TSA可诱导明显的细胞凋亡。结论:TSA可以抑制体外结肠癌Lovo细胞的生长，可能通过细胞周期G1期阻滞及诱导细胞凋亡发挥抑癌作用。TSA可能是结肠癌治疗的潜在靶点。     

小分子RNA干扰同时沉默表皮生长因子受体和胰岛素样生长因子-1受体基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响

目的 观察小分子RNA干扰(riRNA)同时沉默表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响.方法 构建真核表达载体,转染质粒48 h后通过流式细胞仪、噻唑蓝(MTT)检测细胞周期、凋亡、增殖变化以及Western blot检测CDK1、CDK2和p53蛋白的表达.结果 转染48 h后双基因干扰组吸光度为0.2,G0/G1和G2/M期细胞比例分别为72.70±0.26和7.38±0.06,凋亡率为17％,CDK1、CDK2蛋白的表达降低,与对照组和单基因干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 同时沉默EGFR和IGF1R基因能有效干扰肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,并使肝癌细胞阻滞于G0/G1期,干扰多个受体分子可能是一种新的肝癌治疗途经.     

碳水化合物反应元件结合蛋白在肝癌中表达与作用

目的:探讨碳水化合物反应元件结合蛋白(Ch REBP)在肝癌(HCC)中的表达与生物学作用。方法:分别用q RT-PCR、免疫组化、Western blot法检测73例HCC组织与癌旁组织以及多种HCC细胞系与正常肝细胞系中Ch REBP的m RNA与蛋白表达;观察si RNA干扰Ch REBP表达后,HCC细胞周期、凋亡以及增殖的变化。结果:Ch REBP的m RNA与蛋白表达在HCC组织中表达均明显高于癌旁组织、在所有HCC细胞系中均明显高于正常肝细胞系(均P0.05)。干扰Ch REBP表达后,HCC细胞发生明显G1-S期阻滞、细胞增殖明显降低(均P0.05),但细胞凋亡未发生明显变化(P0.05)。结论:Ch REBP在HCC中表达升高,且可能通过调控细胞周期促进HCC细胞的增殖,从而在HCC的发展中起了重要的作用。     

APOBEC3G基因对HepG2.2.15细胞生物学行为的影响

目的 观察HepG2.2.15细胞在高表达APOBEC3G后,APOBEC3G对细胞生长迁移能力、细胞周期和凋亡现象等生物学行为的影响.方法 将真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G转染入HepG2.2.15细胞中,应用有限稀释法筛选高表达APOBEC3G的HepG2.2.15细胞,并通过Western blot鉴定.应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞株生长能力;应用划痕法观察细胞迁徙运动能力.结果 HepG2.2.15-APOBEC3G细胞(pcDNA3.1-APOBEC3G转染)和HepG2.2.15-pcDNA3.1细胞(空载体转染),与HepG2.2.15细胞(空白对照)比较,细胞周期无明显变化[各期细胞所占比例分别为:G0/G1:(64.27±1.26)%比(64.18±1.24)%比(64.09±1.30)%,P＞0.05;S:(23.16±1.38)%比(22.67±1.41)%比(23.27±1.43)%,P＞0.05;G2/M:(11.36±1.26)%比(11.84±1.31)%比(11.37±1.22)%,P＞0.05],未见细胞凋亡现象,细胞的生长增殖无明显变化(P＞0.05),细胞迁徙运动能力无明显变化[24h及48 h细胞迁移抑制率分别为:(7.5±3.7)%比(10.2±5.5)%,P＞0.05;(13.4±6.5)%比(17.8±9.2)%,P＞0.05].结论 高表达APOBEC3G对HepG2.2.15细胞生物学行为无明显影响.     

阿司匹林对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制

目的 观察阿司匹林(AS)对肝癌细胞SMMC-7721生长的作用,并探讨其作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度阿司匹林对肝癌细胞细胞生长的抑制作用以及流式细胞仪检测不同浓度阿司匹林对肝癌细胞细胞周期的影响;免疫组织化学方法检测阿司匹林对肝癌细胞细胞增殖核抗原(PCNA)、环氧合酶-2(COX-2)表达的影响;并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定COX-2基因的表达.结果 肝癌细胞经不同浓度的阿司匹林作用后,其生长抑制率明显升高(P<0.05),且与阿司匹林浓度有关和作用时间相关.细胞周期检测结果显示,经不同浓度阿司匹林作用后的SMMC-7721细胞,细胞周期发生明显变改.表现为随着阿司匹林浓度的增加,S期细胞比例下降明显,G0/G1期及G2/M期细胞比例则上升(10-2、10-3moL/L AS组与对照组比较P<0.05).免疫细胞化学染色显示,阿司匹林能下调肝癌细胞COX-2、PCNA的表达.RT-PCR检测表明,COX-2基因表达电泳条带与对照组比较辉度明显降低,其中10 mmol/L阿司匹林组最低,说明随着阿司匹林浓度增加,COX-2表达逐渐减少,阿司匹林能下调SMMC-7721细胞表达COX-2基因.结论 阿司匹林能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长,这种作用可能是其通过抑制细胞增殖,与抑制COX-2、PCNA的表达有关.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂蛋白去乙酰化酶抑制剂对原发性肝癌细胞增殖的影响

目的 观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)对原发性肝癌细胞增殖的影响.方法 噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(30、150、1000μg/L)TSA对原发性肝癌细胞生长的影响.结果 TSA浓度为30μg/L时,实验组与对照组细胞的吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),说明TSA(30μg/L)对细胞的增殖基本无影响;当TSA浓度达到1000μg/L时,实验组细胞大量崩解、坯死,对细胞产生了严重的毒性作用;当TSA浓度为150μg/L时,实验组细胞无崩解、坏死现象,其36h和48h细胞的吸光度值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 HDAC抑制剂TSA对体外培养的原发性肝癌细胞的增殖生长具有抑制作用,并且这种抑制作用呈现一定剂量依赖性和时间依赖性.     

p27KIP1基因过表达诱导HCC-9204细胞在G1期停滞并导致细胞凋亡

目的：研究p27^KIPI基因对肝癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的调节作用。方法：采用一种可诱导性真核表达载体pMD-neo，通过外加Zn^2 诱导目的基因的表达。脂质体转染法将p27^KIPI全长cDNA转入肝癌细胞系HCC-9204中，检测p27^KIPI基因的表达，对细胞增殖的作用及目的基因对细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：免疫组织化学及RT-PCR显示转染的p27^KIPI基因有高水平的表达。在外加Zn^2 48h后细胞生长被抑制35%，G1期细胞数由35%增加到76%，P=0.000；凋亡指数显著增加（P=0.000）。结论：p27^KIPI基因能够使HCC-9204细胞的G1期延长并导致细胞凋亡。     

抑制核纤层蛋白A/C表达对牵张刺激下成骨细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制核纤层蛋白A/C(lamin A/C)表达对牵张刺激下小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖及凋亡的影响.方法 化学合成3条针对lamin A/C靶点的siRNA序列,脂质体转染MC3T3-E1细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测lamin A/C mRNA和蛋白变化.细胞转染72 h后行牵张刺激6 h,Hoechst 33258检测DNA含量来反映细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及凋亡.结果 筛选出的siRNA-2显著抑制lamin A/C mRNA和蛋白产物表达(P＜0.01).未转染细胞经牵张刺激,DNA合成随时间推移而增加;细胞G0/G1期比例为65.19%;S期为22.57%,细胞凋亡率为11.49%;转染细胞经牵张刺激后,DNA合成较未转染细胞显著性减少(P＜0.01);G0/G1期比例提高至85.82%;S期降低至11.37%,凋亡率达19.32%(P＜0.01).结论 抑制lamin A/C表达会导致牵张刺激诱导的促增殖作用减弱,细胞周期阻滞于G0/G1期,促进细胞的凋亡.