实时荧光PCR检测风疹病毒的应用研究

目的建立风疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的快速检测。方法分析近四十年来流行的风疹病毒E1基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立风疹病毒实时荧光PCR检测方法。对30例临床诊断为风疹的患者标本进行实时荧光PCR检测,并与血清学检测结果进行比对。结果 30例患者标本中实时荧光PCR检测,27份阳性,3份阴性,阳性率为90.0%,远高于血清学检测(阳性率70.0%)。结论该方法具有方便快捷、特异性强、敏感性高等特点,为风疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供了技术支撑。     

ELISA和荧光定量PCR在麻疹实验室诊断中的应用分析

目的 分析比较ELISA和荧光定量PCR对麻疹疑似病例的实验室检测结果,为疾病的尽早确诊及检测方法 的选择提供依据.方法以百色市12个县(区)2013年1月至2015年12月的351例疑似病例为研究对象,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清标本中麻疹病毒IgM抗体,同时应用荧光定量PCR检测咽拭子样本中麻疹病毒核酸RNA,分析比较两法的检测结果 .结果351例麻疹疑似病例中,麻疹病毒IgM抗体阳性160例,阳性率为45.58%;荧光定量PCR检测麻疹病毒核酸RNA阳性167例,阳性率为47.58%;两种方法的阳性率差异无统计学意义(χ2=1.091,P=0.296).对不同出疹时间采集的标本用两种方法检测的阳性率差异亦无统计学意义(P>0.05);有无免疫史患者标本两种方法检测的阳性率基本一致.结论 ELISA和荧光定量PCR用于麻疹疑似病例的实验检测结果无明显差异,各实验室可根据自身情况选择其中之一.     

多重荧光定量PCR检测麻疹和风疹病毒的效果评价

目的评价多重荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测麻疹和风疹病毒核酸的效果。方法对包括麻疹、风疹、水痘、登革热、流行性腮腺炎、艾滋病毒(HIV)、流感、乙肝、丙肝、乙脑10种病毒和阴性对照共143份标本分别提取核酸,进行多重荧光定量PCR试验和普通反转录PCR(RT-PCR)扩增麻疹、风疹病毒特异性片段并测序。对两种方法的检测结果进行比对,进行配对卡方McNemer检验和Kappa一致性检验。结果该多重荧光定量PCR方法的灵敏度为100.00%,特异度为94.67%,假阳性率为5.33%,假阴性率为0。多重荧光定量PCR和普通RT-PCR法一致性检验参数κ=0.94。结论该多重荧光定量PCR方法灵敏度高,特异性好,与其他常见病毒无交叉反应,且含有内标作为采样环节的质控,适于麻疹和风疹病毒的快速诊断。     

实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的早期诊断和疫情监测。方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqm an探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对。结果:本法线性范围5×102~5×107拷贝/ml,检出限5×101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035~0.39,CV=0.13%~1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%。结论:本研究建立Taqm an实时荧光定量PCR用于对虾IH-HNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。     

麻疹病毒检测中实时荧光定量RT-PCR的价值分析

目的评价麻疹病毒检测中实时荧光定量RT-PCR的应用价值。方法选取疾病预防控制中心在2013年4月至2014年12月期间收治的70例疑似麻疹病例,采集患者血清标本及咽拭子标本,分别采取酶联免疫吸附试验(ELISA)法、RT-PCR法检测;比较两种检测技术检测结果。结果 ELISA法检测血清标本IgM抗体阳性率10.77%,RT-PCR检测阳性率为24.62%,数据具显著性差异(χ~2=4.279,P=0.039);ELISA法于出疹1～3d内总检测阳性率为42.86%,RT-PCR法于出疹1～3d内总检测阳性率为93.75%,数据差异具显著性(P0.05)。结论对麻疹病毒采取实时荧光定量RT-PCR检测,具较高的灵敏度,操作简单,值得临床推广。     

实时荧光定量PCR检测特殊人群中HCV-RNA的研究

[目的]探讨HCV在特殊人群中的流行和干扰素治疗效果对HCV-RNA含量的影响。[方法]收集223份抗-HCV阳性血清并跟踪观察和用荧光定量实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA的含量。[结果]在141份抗-HCV阳性血清中,58份实时荧光定量PCR阳性,阳性符合率为41.13%,在86份有输血史患者中39份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为45.35%,17份有家族遗传史患者中11份实时荧光定量PCR阳性符合率为64.70%。在38例不明原因感染者中有8份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为21.05%（χ^2=16.21Р=0.000）。58例实时荧光定量PCR阳性的病人经治疗两年后,39份有输血史患者,转阴24例,转阴率61.53%。11份有家族遗传史患者中6例转阴,转阴率54.54%。在8例不明原因感染者中有5例转阴,转阴率62.24%。[结论]不同的传染途径在RNA的含量和治疗的预后有差异。     

利什曼原虫实时荧光定量PCR方法建立与应用

目的 建立一种利什曼原虫的实时荧光定量PCR检测方法,快速准确的检测利什曼原虫,为黑热病防治提供技术支撑。方法 根据利什曼原虫Kinetoplast基因保守区序列,设计合成一对引物探针。用磁珠法在外周全血中提取利什曼原虫的DNA后,应用荧光定量PCR方法进行检测,灵敏度和特异度达到了设计要求,并应用在日常检测工作中。结果 对比r K39抗体检测方法,结果更加灵敏,并具有较高的特异性。该方法在黑热病疑似病例检测中特异性好;在犬血检测中对比r K39抗法差异有统计学意义(χ²=3.938,P=0.047)。结论 该方法能够快速准确地检测利什曼原虫,在黑热病实验室诊断、黑热病流行病学监测中具有极大的应用价值。     

麻疹实验室诊断中ELISA法和实时荧光定量RT-PCR法的比较研究

目的比较诊断早期麻疹病毒感染的两种实验室方法,即检测患者血清中特异性IgM抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）以及检测病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR法。方法收集麻疹疑似病例急性期静脉血和咽拭子,采用ELISA法检测血清中麻疹特异性IgM抗体,实时荧光定量RT-PCR法检测咽拭子麻疹病毒RNA。结果142例麻疹疑似病例中,血清ELISA法检测阳性率为30.99%（44/142）,实时荧光定量RT-PCR法检测阳性率为69.72%（99/142）,实时荧光定量RT-PCR法检测阳性率明显高于ELISA法检测阳性率（P<0.001）。综合以上两种方法检测结果,实验室确诊病例总数为106例,总阳性率为74.65%（106/142）,ELISA法灵敏度为41.51%（44/106）,实时荧光定量RT-PCR法灵敏度为93.40%（99/106）。出疹后第1至第3天,ELISA法检测阳性率分别为 23.81%、29.41%、44.83%;实时荧光定量RT-PCR法检测阳性率分别为74.19%、70.77%、80.77%。结论实时荧光定量RT-PCR法灵敏度高于血清ELISA法,更适合于麻疹病毒感染早期的实验室诊断。     

实时荧光定量PCR技术在疫情和食物中毒检测中的应用

实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术是一种日益成熟的生物体核酸检测技术,由于其具有快速、特异、敏感、定量、安全、操作简便等特点,在医学诊断、卫生防疫等领域中得到广泛的应用。目前,针对常见疫情和食物中毒中的病源微生物,已设计和开发了相应的特异性引物及探针,可以对这些微生物进行快速检测,从而提高了政府及相关部门应对和解决突发公共卫生事件的能力。     

呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR的检测

目的 建立多重实时荧光定量PCR检测方法,为实现对呼吸道病原体的快速、灵敏特异性检测.方法 采用经报道的引物和探针对合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道病原体进行多重实时荧光定量PCR检测.结果 多重荧光定量PCR阳性检测率高达57.8%,无假阳性及假阴性,特异性强.结论 多重实时荧光定量PCR具有经济、快速、特异性强等优点,在呼吸道病原体检测方面有巨大应用价值.     

两种不同方法检测乙肝病毒血清学标志物比较及其临床意义

目的比较两种不同检测方法FQ-PCtL和ELISA定性检测HBVM及其临床意义。方法对106例乙肝病毒血清同时进行FQ—PCK检测HBV-DNA及ELISA方法测定HBVM。结果不同的血清学模式，HBV—DNA阳性率有差异，其中HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、g-HBc（＋）和HBsAg（＋）、抗-HBe（＋）、抗-HBc（＋）模式的HBV—DNA阳性率高。结论FQ—PCIL检测患者血清HBV—DNA含量可以准确地反映HBV的感染状态和复制情况，具有较高的临床应用价值。     

茂名市首例甲型H1N1流感病例的实时荧光RT—PCR检测

[目的]对茂名市首例甲型H1N1流感病例进行病毒核酸检测,为甲型H1N1流感疫情的防控提供参考。[方法]采用实时荧光逆转录PCR法对采集的病人咽拭子标本进行甲型H1N1流感病毒核酸检测。[结果]共采集病人2份咽拭子标本,其中1份咽拭子标本的实时荧光RT—PCR检测结果显示H1及N1的RT—PCR反应体系扩增曲线有明显对数增长且Ct值分别为25．21（H1）和25．07（N1）,为甲型H1N1流感病毒核酸阳性;另1份咽拭子标本则呈阴性。后采集第3份咽拭子标本连同第1分标本送广东省疾控中心复检,结果2份标本的甲型H1N1流感病毒核酸检测均为阳性。[结论]这名病人为福建省第2例甲型H1N1流感病毒感染者的密切接触者,由于及时采用灵敏度高,特异性强,检测时间短的实时荧光逆转录PCR方法检测,快速确诊了病例,为疫情的控制争取了时间,防止了2代病例的出现。     

沙门菌和志贺菌二联实时荧光定量PCR的临床检测应用研究

目的:进行沙门菌和志贺菌二联实时荧光PCR检测的研究,并探讨在CDC体检中临床检测的应用.方法:在沙门菌、志贺菌的fimY基因和缸ipaH基因保守区设计特异性引物和探针,对引物、探针、Mg2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,并与传统检测方法进行对比.结果:该方法从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,对两种菌的检测灵敏度均达到100 cfu/ml,检测自2007年11月以来CDC临床肛拭子样本5896份,实验结果与权威检验机构的结果符合率达100%.结论:二联实时荧光定量PCR可同时定量的检测出沙门菌和志贺菌,灵敏度高,特异性强,检测周期短.适用于CDC体检等同时对沙门菌和志贺菌的快速临床检测.     

黄热病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立黄热病毒的实时荧光定量PCR检测技术,以实现黄热病毒感染早期的筛选和检测.方法 以带有黄热病毒基因质粒为阳性模板,采用TaqMan探针法,制作标准曲线,以实现对黄热病毒的简单快速的高灵敏度、高特异性实时检测.结果 该方法检测的最低拷贝数可以达到3.457 copies/μl.组内及组间变异系数均低于5％,证明该方法具有良好的敏感性及稳定性.以1～4型登革病毒和乙脑病毒基因组为模板,检测结果为阴性,证明该方法有良好的特异性.结论 该方法可快速、灵敏、特异、定量检测黄热病毒,能用于黄热病毒感染的早期诊断.     

实时荧光定量PCR在手足口病原体检测中的应用探讨

目的：：对手足口病患儿施行病原体检测时运用荧光定量PCR实时测定法（FQ-PCR法）的效果及有关情况探析。方法：以2016年5月-7月因疑似感染手足口病进入本院施行病原体测定的患儿127例为评估对象,依据年龄段情况将其划分成A组（年龄不超3岁者）77例、B组（年龄间于3-6岁间者）50例,运用FQ-PCR法对疑似患儿的疱疹液、咽拭子实施相应指标值的测定;并以ELISA法对患儿血清展开检测,经比对两法的检出率数据情况,系统评估FQ-PCR医疗检测效果。结果：127例患儿咽拭子样本、疱疹液样本在FQ-PCR法测定下,EV检测有101例显阳性,占79.53%;当中A组有67例,占87.01%,B组有34例,占68.00%。A组患儿阳性检出率超出B组,差异明显（P＜0.05）。咽拭子样本检出阳性率是69.60%,疱疹液样本检出阳性率是81.97%。FQ-PCR法检出EV71阳性病例超出ELISA法,差异显著（P＜0.05）,检出COXA16阳性病例和ELISA法较接近,没有较大差异（P＞0.05）。结论：FQ-PCR 法践行于HFMD病原体测定及评估中,能强化病原学指标监控力度,以辅助当地HFMD疫情预测、防范工作的有效进行。     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

TaqMan荧光定量RT—PCR快速检测西尼罗病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。     

实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果。方法选取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件进行分析,采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测,观察检测阳性率和阳性样本的类型,以分析流感的流行趋势。结果 2009年9月—2013年12月共检出流感病毒核酸阳性676件,检测阳性率为27.16%;其中甲型H1N1病毒472件,占69.82%;季节性甲3亚型病毒126件,占7.54%;季节性甲1型病毒21件,占3.11%;乙型病毒6件,占0.89%;各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。每年6-9月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势,在10-11月达到高峰期;6-9月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株,10-11月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。结论实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法,可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测,分析流感病毒的流行规律,有效预防突发公共卫生事件的发生。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较

沙门菌是一种常见的重要人兽共患病原菌，在自然界中分布广泛，它极易污染水源、食品及畜产品，引起人食物中毒、急性胃肠炎和动物腹泻等疾病。目前国内外对该菌的快速检测主要集中在免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）技术等方法上。而实时荧光PCR（Real-timePCR）是近几年兴起的分子生物学检测技术，其检测灵敏性高，特异性好且操作简便，耗时少。