一种抗体融合蛋白Ni柱亲和层析纯化效果的研究

随着蛋白表达技术的不断发展与优化，发酵液上清中蛋白表达量不断提升，对下游纯化工艺提出了更高的要求，亟需开发高质高效的纯化工艺。Ni亲和层析是一种传统捕获目的蛋白的常用纯化方法。目前市面已有多种Ni亲和层析介质，其配基为螯合剂共价偶联到4%交联的琼脂糖介质上，再螯合Ni²⁺制备而成，但不同类别的Ni亲和层析介质配基有各自的基质和配位螯合技术，不同蛋白也有自身特性，从而造成介质对目标蛋白亲和力以及洗脱纯度有所差异。针对某抗体药物的纯化工艺探索，比较了3种不同的Ni亲和层析介质动态载量，从上样体积和平衡液咪唑浓度两方面进行该抗体融合蛋白Ni柱纯化条件筛选，并分析纯化后样品SEC纯度、总量、得率。综合考量除杂效果、总量、得率三个因素可知，Ni-IDA 6FF介质最适合该抗体融合蛋白的纯化，且纯化效率最高。     

固定化金属亲和层析胶与亲和层析膜纯化rhMn-SOD和rhCu,Zn-SOD的比较研究

为比较固定化金属亲和层析膜与亲和层析胶的纯化效果,分别用固定化金属亲和层析胶Cu2 柱、Ni2 柱、固定化金属亲和层析膜Cu2 柱、Ni2 柱分离纯化rhCu,Zn-SOD、rhMn-SOD/24a、rhMn-SOD/28.结果表明,亲和胶与亲和膜分离SOD获得相似的纯化效果,纯化倍数均在3到5之间,亲和膜分离所得SOD比活略高于亲和胶,rhCu,Zn-SOD与Cu2 的亲和能力高于rhMn-SOD.固定化金属亲和层析膜色谱为基因工程产物的快速分离鉴定提供了一个简便的方法.     

渗透压冲击预处理提高金属螯合亲和色谱纯化IGF-1融合蛋白的效率

目的采用渗透压冲击预处理细菌以提高重组IGF-1融合蛋白纯化中金属螯合亲和色谱的效率。方法采用20%的蔗糖-EDTA缓冲液预处理经诱导表达的大肠杆菌,然后将表达产物经Ni-NTA-琼脂糖亲和色谱柱进行分离,观察蔗糖溶液处理对纯化效果的影响。结果经蔗糖-EDTA缓冲液预处理后Ni-NTA-琼脂糖色谱柱纯化蛋白的产量可以提高约2倍。结论渗透压冲击预处理可以有效提高金属螯合亲和色谱的效率。     

阿尔采末病Aβ多肽基因的高效表达及纯化研究

目的　通过对Aβ多肽基因进行重组克隆 ,构建质粒和高效表达的菌株 ,并研究表达产物快速高效的纯化回收方法。方法　采用IMPACT TWIN表达系统构建Intein Aβ重组基因表达质粒 ,将该质粒转化至BL2 1(DE3) ,筛选高效表达菌株 ;表达产物经ChitinBeads亲和层析柱分离纯化 ;SDS PAGE电泳 ,毛细管区带电泳及免疫印迹法等鉴定。结果　重组的Intein Aβ基因在BL2 1中获得高效表达 ,筛选出稳定高效表达的BL2 1(DE3)细胞株 ;融合蛋白表达量可达全菌蛋白的 6 0 % ;表达产物经ChitinBeads亲和层析纯化后 ,其纯度可达 98%以上 ,并具有与Aβ多肽相同的分子量及免疫学活性。结论　Aβ多肽基因在IMPACT TWIN系统中可获得高效表达 ,利用ChitinBeads亲和层析方法可将表达的Aβ多肽进行快速、简便、无酶化的高效分离纯化。     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

人胰岛素样生长因子-l的原核表达和纯化

目的构建高表达、易纯化的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)工程菌。方法采用pET32a(+)质粒构建带羟胺裂解部位的表达载体,转入大肠杆菌DH5α进行诱导表达。表达产物经镍离子-亲和柱色谱分离后进行羟胺裂解。裂解产物纯化后用MALDI-TOF-MS法测定相对分子质量(Mr)。结果重组质粒序列完全正确。工程菌可表达预计Mr的融合蛋白,经Western blot证实有hIGF-1抗原活性。经镍离子-亲和柱色谱分离、羟胺裂解后得到的肽的Mr为7 640,和理论值相符。结论成功构建了表达hIGF-1的工程菌,为开发hIGF-1奠定了基础。     

金属螯合亲和层析分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶

以金属铜螯合的亲和层析方法分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶，采用3种不同的洗脱方法都可以对重组酶进行分离纯化，但是通过鉴别比较，采用方法1即逐步降低洗脱液的pH和固定洗脱液的NH4^ 的浓度可以获得较好的结果，SDS－和丙烯酸胺凝胶电泳得到一条分子质量约为2200u的蛋白条带，证明所得到的为纯度高的重组人锰氧化物歧化酶（rhMn-SOD）。     

梅毒螺旋体重组抗原TpN47的纯化工艺研究

目的 以含有TpN47基因的表达菌体为原料,纯化梅毒螺旋体重组抗原TpN47,并提高产品收率.方法 表达菌体经超声破碎后离心取沉淀,沉淀变性溶解后采用金属螯合亲和层析进行纯化.通过对层析异常现象的分析和优化层析工艺操作提高收率.结果 所得纯品经SDS-PAGE分析表明可用于检测梅毒相关抗体,优化后的操作工艺使产品收率大幅提高.结论 利用金属螯合亲和层析可纯化得到符合要求的梅毒螺旋体重组抗原TpN47,通过改善层析操作提高目标蛋白收率是可行的.     

刺桐胰蛋白酶抑制剂的高效表达、纯化、亲和介质的制备及其在r-PA纯化中的应用

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够特异性结合胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂,抑制其活性。因此ETI可以作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质,用于tPA(组织型纤溶酶原激活剂)及其突变体的纯化。利用基因工程方法构建了ETI的高表达工程菌株,诱导表达后目的蛋白占总蛋白的39.6%,经包涵体变性、复性、纯化,制备了纯度高于96%的ETI样品,收率达到了63.5%。利用纯化的ETI,偶联制备了亲和层析介质,偶联率达到99%。用制备的ETI亲和层析介质纯化瑞替普酶(r-PA),获得的r-PA样品纯度高于95%,生物学活性高于5×105U/mg。本研究为ETI的进一步生产及应用奠定了基础。     

重组人干扰素α2a分离纯化中试工艺研究

目的探索无单克隆抗体亲和层析的重组人干扰素α2a分离纯化工艺。方法用 7mmol·L-1盐酸胍抽提干扰素 ,然后用金属螯合层析、离子交换层析、反相柱层析和凝胶过滤将提取的干扰素纯化。结果目标蛋白纯化了 195 1倍 ,蛋白比活性达 2 4 0× 10 8IU·mg-1,回收率达 30 1%。SDS PAGE检定呈一条带 ,其分子质量约为 19kD ,纯度大于 97%。结论本工艺降低了生产成本 ,易于扩大生产规模 ,适合产业化要求。     

抗栓肽基因的克隆和表达

抗栓肽(Decorsin)是糖蛋白Ⅱb-Ⅲa(GPⅡb-Ⅲa)的强拮抗剂,能抑制血小板聚集。实验通过设计两对引物,经PCR获得抗栓肽的结构基因,并将基因插入原核表达载体pET32a硫氧还蛋白(TrxA)的下游。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,表达产物以可溶形式存在于胞内,占菌体总蛋白的35%。利用表达载体自身所带的His×6纯化标签,可将融合蛋白通过金属螯合亲和层析柱一步纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析达到电泳纯。体外的抑制血小板聚集实验结果表明,融合蛋白具有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集活性,抑制常数IC50为500 nmol/L。     

人TNFβ缺失体融合表达及其产物一步纯化法研究

本文将h TNFβN端缺失23aa的缺失体基因克隆于pET-28-C(+)表达载体,构建成T7lac启动子控制下His6-TNFβ融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,His6-TNFβ表达量约占总菌体蛋白的25%,Mr 20500.表达产物大部分以包涵体形式存在.包涵体经过洗涤,70mol/L脲变性溶解,用Ni2+亲和层析一步快速纯化,所得His6-TNFβ的纯度达90%以上,回收率在90%左右.纯化产物稀释复性后,其细胞毒活性为(0.5～1.0)×106U/mg 蛋白左右.这些研究结果将为制备重组人TNFβ缺失体以及进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

rhEPO蛋白亲和层析条件的探索

亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,对那些分离流程长、难度大、浓度低、杂质多,采用常规方法难以进行分离的生物分子来说,亲和层析显示出其独特的优越性.本文采用亲和层析法对含rhEPO蛋白的细胞上清液进行初步纯化,旨在探索其最佳洗脱条件.     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化

目的在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质。方法PCR扩增HlrgcDNA编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导。表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞。结论在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础。     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141的表达和生物活性测定

目的：建立表达及纯化重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（rhPTHrP1-141）的方法。方法：将已构建好的表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141重组质粒转化大肠杆菌M15[PREP4]，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。金属螯合亲和层析去除杂蛋白后，超滤离心进一步纯化目的蛋白。使用UMR106细胞测定所制备的rhPTHrP1-141对cAMP生成的刺激作用。结果：SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为rhPTHrP1-141。目的蛋白经纯化后，能刺激UMR106细胞内cAMP浓度升高，有剂量依赖关系。结论：成功建立了rhPTHrP1-141的制备及纯化方法，PTHrP1-141的表达量可达到60mg／L培养基。表达产物经体外实验证实具有生物活性。     

抑肽酶的亲和层析

介绍用琼脂糖、β-硫酸酯基乙砜基苯胺(SESA)和胰蛋白酶制备亲和吸附剂,以及用该亲和柱纯化抑肽酶的条件。本亲和吸附剂经α-萘酚处理后稳定性有显著提高;经亲和层析纯化后的抑肽酶圆盘电泳呈一条谱带。     

人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达 CYP1 A1 (第 2 4 1- 381个氨基酸 )与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)的融合蛋白作为抗原 ,用于制备 CYP1 A1多克隆抗体 .根据正反重组质粒 p GEX/ 1 A1表达的融合蛋白大小不同的原理 ,直接表达筛选得到正向重组质粒p GEX/ 1 A1 .通过优化表达条件 ,提高了目的蛋白的表达水平 .包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离 ,获含纯化融合蛋白 GST- 1 A1的 PAGE凝胶 .直接用含 GST- 1 A1的凝胶悬液免疫 BALB/ c小鼠 ,自腹水中获取 CYP1 A1多克隆抗体 (1 A1 p Ab) . 1 A1 p Ab用切胶纯化的融合蛋白GST- 2 B6交叉吸收 ,蛋白 A- Sepharose亲和层析柱来纯化 .用切胶纯化的融合蛋白 GST- 1 A1及 GST-2 B6的免疫印迹反应初步鉴定 1 A1 p Ab的特异性 .纯化的 1 A1 p Ab对融合蛋白 GST- 1 A1反应特异性较强 ,但仍对 GST- 2 B6有弱交叉反应 .在实际应用中可根据反应强度来加以区分     

蝰蛇(缅甸亚种)毒促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb的分离纯化及生物活性

目的从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离纯化一种促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb,并研究其理化性质和生物活性。方法应用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析Sephadex G-150(超细)凝胶过滤层析Chelating Sepharose Fast Flow金属离子螯合亲和层析分离纯化蛇毒,反相HPLC检测组分FⅥbb纯度,采用MALDI质谱测定法测定分子量,以发色底物法、纤维平板法和SDS-PAGE测定FⅥbb的酶学特征和生物活性。结果从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离得到的促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb为单体蛋白,相对分子质量为59 138,最适温度为40℃,最适pH为10.0,为金属蛋白酶。结论应用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析和Chelating Sepha-rose Fast Flow金属离子螯合亲和层析等方法可以从蝰蛇(缅甸亚种)毒纯化出促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb,具有促凝—纤溶双相活性。