运用组织工程原理结合纳米技术构建骨组织的实验研究

目的 探索表面有纳米级沟槽的冻干脱钙骨基质（freeze-dried demineralized bone matrix with nanoscale topography，nFDBM）的制备方法，并探讨其构建组织工程骨的可行性。方法取犬趾皮质骨按改良Urist法制备FDBM，经掺钕钇铝石榴石（Nd：YAG）激光处理后，与犬自体骨髓间充质干细胞诱导分化来的成骨细胞体外构建nFDBM-细胞复合物，原子力显微镜及扫描电镜观察材料表面不同形态特征对细胞行为的影响;同时将片状nFDBM复合物植入右侧犬背深筋膜袋内（实验组A），短管状nFDBM植入右侧趾骨节段性缺损处（实验组C），以片状FDBM-成骨细胞复合物（对照组B）及短管状FDBM（对照组D）植入同一犬体内左侧相对应位置作为对照，术后第4、8、12周行X线片、组织学及扫描电镜观察。结果FDBM经Nd：YAG激光处理后表面形成了规则的纳米级沟槽状三维结构（深150nm，宽600-800nm）。成骨细胞在nFDBM上的黏附密度及分泌基质量均高于FDBM。实验组复合物植入体内12周时，HE染色、扫描电镜发现材料纳米沟槽一侧、材料内有新生骨组织，X线片检查呈部分钙化，而对照组几无成骨表现，其中X线片表现评分差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Nd：YAG激光可在FDBM表面形成纳米沟槽结构，该结构有利于成骨细胞的黏附、生长和基质分泌。以组织工程方法结合纳米技术构建的nFDBM，成骨细胞复合物植入动物模型体内表现出一定的成骨能力。     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。     

异体冻干脱钙骨基质隆鼻的实验研究及临床应用初步报告

为了研究异体冻干脱钙骨基质在隆鼻术中的应用效果，作者利用正常新鲜四肢骨干皮质骨经脱脂、脱钙、清毒、冷冻干燥等过程，制备成冻干脱钙骨基质。动物实验中观察到将该种材料植于骨膜下和皮下时均有成骨现象，且植于骨膜下的成骨量优于皮下。临床上利用冻干脱钙骨基质进行隆鼻术，将该材料植于鼻骨表面，对１５例受术者中的８例进行了５～１８个月的随访，取得了较满意的效果。作者认为冻干脱钙骨基质有良好的诱导成骨作用，同时该材料易于雕刻修整，不发生排斥反应，能够长期保存，因此作为隆鼻衬垫材料具有可行性     

新型双相陶瓷材料复合成骨细胞构建人工骨及其体内成骨的观察

目的 观察骨髓来源的成骨细胞与新型双相陶瓷材料复合培养后细胞生长状况及其体内异位成骨能力。方法 将来源于兔骨髓的成骨细胞与新法制备的HA／TCP共培养2周，通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况；然后将复合物自体异位植入体内，6周后观察体内成骨情况。结果 扫描电镜显示材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长，有良好增殖活动性和稳定细胞表型，材料中心区未见细胞生长；植入体内6周后取材见内植物有新骨形成、多位于内植物表面，可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论 新型双相陶瓷支架可用作组织工程骨的细胞外基质材料，骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞。     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

经骨向诱导的骨髓间充质干细胞在脱钙骨上生长行为的实验研究

目的:建立成骨细胞-脱钙骨支架复合物,观察其诱导成骨能力,从而探寻组织工程化骨的体外构建方法.方法:运用细胞沉淀法将大鼠BMSCs诱导形成的成骨细胞接种于脱钙骨支架,通过扫描电镜(SEM)、免疫荧光观察脱钙骨表面细胞生长情况,通过上清液碱性磷酸酶(ALP)活性及Ⅰ型前胶原羧端肽(PICP)、骨钙素检测观察成骨细胞活性.结果:扫描电镜示成骨细胞在脱钙骨表面生长良好,上清液ALP、PICP及骨钙素表达均明显高于对照组(P＜0.05),并随时间的增长而显著增加(P＜0.05).结论:采用细胞沉淀法成功将成骨细胞接种于脱钙骨支架,成骨细胞在支架材料中增殖旺盛,细胞活性状态良好,具有良好的骨形成能力,脱钙骨支架可作为骨组织工程中载体支架的较优选择.     

新型双相陶瓷材料复合成骨细胞构建人工骨及其体内成骨的观察

目的 观察骨髓来源的成骨细胞与新型双相陶瓷材料复合培养后细胞生长状况及其体内异位成骨能力。方法 将来源于兔骨髓的成骨细胞与新法制备的HA/TCP共培养2周,通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况;然后将复合物自体异位植入体内,6周后观察体内成骨情况。结果 扫描电镜显示材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好增殖活动性和稳定细胞表型,材料中心区未见细胞生长;植入体内6周后取材见内植物有新骨形成、多位于内植物表面,可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论 新型双相陶瓷支架可用作组织工程骨的细胞外基质材料,骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞。     

成骨细胞特异性钙黏蛋白涂布脱钙骨基质材料对BMSCs黏附及成骨分化能力的影响

目的 探讨成骨细胞特异性钙黏蛋白(cadhefin ectodomain Ⅱ,Cad-Ⅱ)涂布于同种异体脱钙骨基质材料(freeze-dried demineralized bone matrix,FDBM)对兔BMSCs黏附、增殖及成骨分化能力的影响.方法 取4周龄日本大耳白兔10只,体重0.61～0.88 kg,雌雄不限,常规分离培养BMSCs.取第2代BMSCs(细胞密度1×106个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合,行MTT检测细胞增殖能力,细胞黏附实验检测细胞上架率和上架数,倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察细胞生长情况.另取第2代BMSCs(细胞密度5×105个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合培养,行ALP活性检测和骨钙素免疫组织化学染色观察细胞成骨分化情况.结果 MTT检测发现BMSCs在经Cad-Ⅱ修饰的支架材料上能正常增殖,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).实验组细胞上架率为87.41%±5.19%,明显高于对照组35.56%±0.75%(P<0.01);对照组每片材料细胞上架数平均为2.6×104个,实验组平均高达5.0×105个,明显多于对照组(P<0.05).倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察均显示实验组支架上黏附细胞数量明显多于对照组.成骨诱导培养7 d,实验组和对照组细胞均可表达骨钙素,具有成骨细胞表型;培养14 d,实验组和对照组ALP活性分别为29.33±1.53和18.31±1.32,骨钙素免疫组织化学染色阳性率分别为83%±7%和56%±7%,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01);与同组7、21 d比较差异有统计学意义(P<0.01),7 d与21 d组间及组内比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 Cad-Ⅱ修饰的FDBM对BMSCs增殖无明显促进作用,但能提高细胞黏附性,并促进BMSCs向成骨细胞分化.     

兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程的超微形态结构观察

目的观察并探讨骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化过程中细胞超微形态结构的变化及相互联系。方法抽取成年兔髂骨骨髓，分离、培养骨髓基质细胞，1周后分别采用含诱导因子的条件培养液和不含诱导因子的标准培养液继续培养，2周后收集细胞，应用透射电镜观察其超微结构；同时分别将上述两组细胞与煅烧骨体外复合并在原培养液中继续培养，分别于复合1、7、14d取出，用扫描电镜观察细胞表面超微形态。结果透射电镜下见诱导前的骨髓基质细胞浆少，核大，细胞器不发达，处于早期幼稚阶段，而诱导2周后的细胞核小、胞浆多，细胞器丰富，处于较为成熟阶段。扫描电镜下见复合培养2周内诱导前后的骨髓基质细胞均由圆盘形向多角形、条带状相互融合、重叠生长，诱导2周后的骨髓基质细胞间可见大量胶原纤维等基质成分以及钙盐颗粒，而诱导前的细胞始终未见基质分泌及钙盐颗粒。结论成骨诱导后，骨髓基质细胞内细胞器等超微结构极为丰富，细胞表面及细胞间有大量细胞外基质分泌和钙盐沉积。透射电镜和扫描电镜可动态观察骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中细胞超微形态结构的变化。     

骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白行兔腰椎横突间融合

 目的 探讨骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白进行兔腰椎横突间融合的效果。
方法 体外分离、培养骨髓间质干细胞,复合于脱钙骨基质材料,以骨形态发生蛋白进行成骨化诱导。日本大耳白兔60只,随机分为三组,A组以骨髓间质干细胞+脱钙骨基质+骨形态发生蛋白、B组以脱钙骨基质、C组以自体髂骨行L_5,6横突间融合。术后8周取腰椎标本,评估植入材料融合情况;行DR片灰度分析,计算成骨密度及成骨面积;行CT扫描三维重建观察横突间融合形态。HE染色分析横突间融合组织结构。
结果 大体可见A组及C组植入材料与宿主横突融合,融合组织质地硬,形态不规整;B组横突间植入材料大部分被吸收。DR片示A组与C组横突间呈高密度影,成骨密度不均;B组未达到骨性融合。CT示A组与C组融合标本有明显的连续骨痂通过横突间区;B组未见连续骨痂。A组成骨密度和成骨面积均高于B组,与C组无差异。组织学观察示A组与C组大量软骨形成,靠近横突处新生骨小梁形成;B组横突间连接主要为纤维组织。
结论 骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白行兔腰椎横突间融合,其成骨能力接近自体髂骨,优于单纯应用脱钙骨基质。     

多孔钽材料细胞毒性、生物相容性及体内成骨性研究

 目的 探讨国产多孔钽材料的细胞毒性和生物相容性,并通过兔骨内植入成骨示踪观察其成骨作用。方法 扫描电镜观察并测量多孔钽的形态学特征。来源于新西兰胎兔颅盖骨的成骨细胞以多孔钽浸提液（实验组）及完全培养基（对照组）培养,MTT法检测多孔钽的细胞毒性及其对增殖的影响。成骨细胞与多孔钽体外复合培养,观察成骨细胞的黏附、生长及增殖。雄性新西兰大白兔24只,制备股骨髁上多孔钽棒植入模型;4只动物于术后第5天和第19天分别肌肉注射荧光素钙黄绿素和茜素红,术后10 周取材,于488 nm（钙黄绿素激发光）和543 nm（茜素红激发光）波长处,激光扫描共聚焦显微镜观察多孔钽-骨界面成骨;20只动物于术后2、4、8和12 周取材行大体及硬组织切片观察。结果 多孔钽表面及断面可见均匀分布的三维立体连通孔隙结构。MTT法检测显示实验组与对照组细胞随培养时间的延长,其OD值的差异均无统计学意义。扫描电镜显示复合培养早期,细胞在多孔支架表面和孔壁上黏附,相互连接;晚期汇合成片并分泌细胞外基质覆盖材料表面。体内成骨实验显示植入的多孔钽棒与宿主骨结合紧密。硬组织切片显示术后2、4周时多孔钽-骨界面已出现新生骨及小血管,并向孔隙内生长;8、12周时多孔钽表面和孔隙内已长满新生骨组织,新生骨小梁已发育成熟并与材料直接接触。激光共聚焦扫描显微镜显示多孔钽-骨界面及孔隙内可见绿色荧光（钙黄绿素）和红色荧光（茜素红）标记的新生骨组织,红色荧光带位于绿色荧光带周围,早期均呈不连续性,晚期则融为一体。结论 国产多孔钽材料无细胞毒性,具有良好的生物相容性,多孔钽-骨界面为接触及传导性成骨并呈时间依赖性。     

骨髓基质干细胞复合改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯体外构建组织工程化软骨

目的 探讨应用骨髓基质干细胞(BMSCs)复合光接枝改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯(PHBV)构建组织工程化软骨的可行性. 方法 将3代绵羊骨髓基质细胞接种于光接枝改性的三维PHBV支架材料上,24 h后以成软骨诱导液培养,3周后,复合培养物行扫描电镜观察,组织学观察,测定糖胺聚糖(GAG)含量.并将复合物埋植于绵羊腹部皮下,4周后取出,行大体及组织学观察. 结果 经成软骨诱导后,扫描电镜下,BMSCs的突触逐渐变短,由长梭形向扁平形转变,分泌基质量亦明显增多.组织学观察见细胞支架复合物阿利新蓝、番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性.GAG含量测定示诱导3周后,细胞分泌的GAG量(1306.7±192.3)明显高于未经诱导的BMSCs(205.0±26.2)(P<0.001),但仍低于正常软骨细胞(1969.2±235.3)(P<0.001).复合物埋植于皮下4周后,其内炎症细胞浸润明显,但番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性. 结论 以BMSCs为种子细胞,复合改性的PHBV,可于体外构建出软骨样组织,但该组织的理化特点与正常软骨仍有差距.     

An evaluation of human demineralized bone matrices in a rat femoral defect model

The osteoconductive and osteoinductive potential of two human allogeneic demineralized bone matrix putties were compared in a critical-sized athymic rat femoral defect model. Defects were treated with (1) a demineralized bone matrix in a hyaluronic acid carrier, (2) a demineralized bone matrix in a glycerol carrier, (3) a hyaluronic acid carrier alone, or (4) with no implant. Radiographic examinations and histologic analyses were done at 4, 8, and 16 weeks postoperatively. Eight of the 48 defects treated with a demineralized bone matrix and none of the 36 surgical controls showed complete radiographic healing by 16 weeks and no statistically significant difference between the radiographic scores for the two demineralized bone matrix preparations was found. On histologic review, both preparations of demineralized bone matrix had passive remineralization. The largest foci of endochondral ossification were seen in limbs treated with a demineralized bone matrix in a hyaluronic acid carrier. The 8-mm rat femoral defect allows for stringent assessment of the osteoinductive potential of bone graft substitutes. Hyaluronic acid and glycerol are viable carriers for demineralized bone matrices. As both de-mineralized bone matrices tested provided an adequate osteoconductive matrix and showed some, although limited, osteoinductive capacity, these materials should be used in clinical practice only as bone graft extenders or enhancers.     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架的生物矿化研究

目的 探究BMP2重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附脱钙骨(DBM)支架体外构建转基因组织工程骨的生物矿化能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs,用BMP2重组慢病毒转染细胞，通过RT-PCR检测目的基因的表达，利用倒置荧光显微镜观察细胞在DBM支架上的生长情况，借助扫描电镜和能谱分析观测细胞在DBM支架上的表面微观形貌及生物矿化能力。结果 BMP2重组慢病毒成功转染兔BMSCs, RT-PCR显示转染后细胞能高效表达BMP2目的基因，在倒置荧光显微镜下观察见转染后细胞黏附在DBM支架上呈满天星样，并沿DBM支架孔隙内壁贴壁叠加生长、分裂增殖，扫描电镜下见细胞填满整个DBM支架孔隙，分泌大量细胞外基质，并在DBM支架表面形成凹凸不平的光泽结晶矿化物，能谱分析显示其钙磷比(Ca/P)为1.89±0.31,与正常骨组织成分相近(P>0.05)。结论 BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架构建的转基因组织工程骨成功完成了生物矿化过程，体现出较好的生物矿化能力。     

Repair of mandible defect with tissue engineering bone in rabbits

BACKGROUND: The aim of the present study was to investigate the effect of tissue engineering bone composed of bone marrow-derived osteoblasts and demineralized bone in repairing mandible defect. METHODS: Bone marrow-derived osteoblasts of 20 rabbits were cultured and seeded into scaffold of allogeneic demineralized bone to construct tissue engineering bone graft in vitro, which was used to repair the 10 x 5-mm bone defect made in the same rabbit mandible edge. Implant of demineralized bone alone was as the control. Rabbits were killed according to the schedule: five after 2 weeks, five after 4 weeks, five after 8 weeks, five after 12 weeks, and the implants were harvested for gross, radiographic, and histological observation. RESULTS: New bone formation at the margin region of defect and osteogenesis at the centre were observed in the implant of tissue engineering bone, and the bone formation pattern included osteogenesis, osteoconduction, and osteoinduction. In the implant of demineralized bone alone, the major bone formation pattern was 'creeping substitute'. CONCLUSIONS: The tissue engineering bone graft constructed by autogenous bone marrow-derived osteoblasts and allogeneic demineralized bone was better than demineralized bone alone in bone formation capability, which might be an ideal graft for bone defect repair.     

Hybrid constructs for craniofacial reconstruction: sustained gene delivery using demineralized bone matrix putty

These experiments evaluate the efficacy of a demineralized bone matrix putty engineered as a hybrid construct for sustained, site-directed gene transfer using an adenoviral vector. In vitro experiments were performed to evaluate the optimal dosing for gene transfer to fetal calvarial osteoblasts and dural cells and for the sustainability of gene transfer from the hybrid constructs. In the dosing experiments, hybrid constructs were created by combining 0.5 mL of demineralized bone matrix putty (DBX; SYNTHES Maxillofacial, Monument, CO) with 1 x 10(8), 1 x 10(7), or 1 x 10(6) particle-forming units (PFU) of an adenoviral vector carrying the gene encoding green fluorescent protein (AdGFP). These constructs were then placed in direct contact, or in transwell coculture, with fetal murine calvarial osteoblasts or dural cells at a multiplicity of infection (MOI = viral particle/cell ratio) of 1000, 100, and 10. The sustainability of gene transfer was tested through transfer of the hybrid construct to wells containing untransfected cells every 24 hours for 30 days. In both experiments, gene transfer was determined through the visualization of GFP using fluorescence light microscopy 24 hours after the onset of transfection. Optimal dosing for gene transfer occurred at an MOI of 10 for calvarial osteoblasts and 100 for dural cells. At greater concentrations, toxicity was observed in the majority of samples. Gene transfer to fetal dural cells and calvarial osteoblasts was sustained throughout the 30-day period. These experiments suggest that adenoviral vectors could be successfully incorporated within demineralized bone matrix to provide effective, sustained, site-directed gene transfer.     

双相磷酸钙组织工程骨块重建股骨头内骨缺损的实验研究

目的 观察在体外构建的具有仿生结构的双相磷酸钙（biphasic calcium phosphate，BCP）组织工程骨块植入犬股骨头缺损内的骨再生情况及预防股骨头塌陷的效果。方法 以犬股骨头的松质骨样本Micro—CT（micro—computed tomography）图像为基础，提取其中的图像信息，利用三维凝胶叠层成形法制备出具有仿骨小梁结构的陶瓷支架。在体外利用诱导分化的自体骨髓间充质细胞与仿生BCP支架复合，构建组织工程骨块，将其植入10只犬的股骨头负重区骨缺损内；另取10只火作为对照组，在股骨头骨缺损区内打球植入自体松质骨粒，对比观察仿生BCP骨块的植入效果。结果 制备出的股骨头仿生BCP支架具有良好的三维空间结构，支架小梁具有一定的方向性，呈板状模型；细胞在支架表面大量生长。植入动物体内30周后，实验组火股骨头外形基本完整，新生骨质包绕支架小梁并沿支架表面生长，而对照组犬股坩头均出现不同程度的塌陷。结论 仿生BCP组织工程骨块具有良好的生物相容性，植入犬股骨头负曩区骨缺损后，能在一定程度上防止股骨头塌陷。