N-甲基-D-门冬氨酸诱导体外培养的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的　探讨用N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)诱导体外目的　探讨用 N-甲基 -D-门冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate,NMDA)诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡。方法　加入终浓度分别为 1 0、50、1 0 0、2 0 0、3 0 0 μmol· L-1的 NMDA作用 72 h;3 0 0 μmol· L-1NM-DA作用 1 2、2 4、3 6、48、72 h后用透射电镜定性观察凋亡细胞 ,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。结果　经 2 0 0、3 0 0 μmol· L-1NMDA作用 72 h后 RPE细胞凋亡指数分别为 (51 .0 0 0± 1 .4491 ) %和 (74.0 0 0± 1 .71 2 7) %与对照组 (2 .0 0 0 0± 0 .42 1 6) %相比 ,差异有显著性 (t=1 0 .0 66、1 4.790 ,P=0 .0 0 0、0 .0 0 0 ) ,随着 NMDA浓度的增加 ,RPE细胞凋亡数逐渐增多 ;3 0 0 μmol·L-1NMDA作用 2 4、3 6、48、72 h后 RPE细胞凋亡指数分别为(9.0 0 0 0± 0 .73 79) %、 (1 3 .0 0 0 0± 1 .0 593 ) %、(2 5.0 0 0 0± 0 .70 71 ) %、(53 .0 0 0 0±0 .82 3 3 ) %与对照组 (2 .0 0 0 0± 0 .42 1 6) %相比差异有显著性 (t=2 .0 1 4、3 .1 65、6.61 8、1 4.676,P=0 .0 50、0 .0 0 3、0 .0 0 0、0 .0 0 0 )。结论　 NMDA能诱导体外培养的人胚胎 RPE细胞     

上皮生长因子在家兔视网膜色素上皮细胞培养中的作用

本研究对有色家兔视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞进行体外培养，结果显示：低浓度上皮生长因子ＥＧＦ对ＲＰＥ细胞无刺激作用，而达到适当浓度时对ＲＰＥ细胞有明显刺激作用，但高浓度与适当浓度的作用相同。本文认为适当浓度的ＥＧＦ可促进ＲＰＥ培养细胞生长，缩短传代周期，细胞增殖速度快，细胞数量明显增多，且细胞形态不受影响。ＥＧＦ对体外培养ＲＰＥ细胞的最佳浓度为１０ｎｇ／ｍｌ，这为在体外大量培养ＲＰＥ细胞提供了新的实验数据     

生长因子对培养人眼视网膜色素上皮细胞增殖的调控作用

目的探讨生长因子对人眼视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＲＰＥ）细胞增殖的调控作用。方法建立人眼ＲＰＥ细胞培养体系，利用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法和细胞计数观察表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂ－ＦＧＦ）、胰岛素样生长因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＩＧＦ－Ｉ）对培养ＲＰＥ细胞的作用。结果（１）ＥＧＦ，ｂ－ＦＧＦ，ＩＧＦ－Ⅰ与对照组比较，可明显增强人眼ＲＰＥ细胞ＤＮＡ合成６．６～１２．２倍，增强能力为ＥＧＦ＞ｂ－ＦＧＦ＞ＩＧＦ－Ⅰ。（２）当生长因子联合作用时，可数倍明显增强３Ｈ－ＴｄＲ掺入，能较单一因子更有效地刺激人眼ＲＰＥ增殖。结论结果提示，生长因子的协同作用可能是增殖性视网膜病变发生的重要机理之一。     

多巴胺D2受体和腺苷A2A受体在人视网膜色素上皮细胞表达的研究

目的探讨正常人眼视网膜色素上皮（RPE）细胞多巴胺D2受体和腺苷A2A受体表达情况。方法采用已建立的RPE细胞的分离和培养方法建立细胞株。取传3—4代生长良好的细胞,应用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、细胞免疫组化方法检测培养的RPE细胞中多巴胺D2受体和腺苷A2A受体的表达情况。结果培养的RPE细胞呈多边形,平均分裂时间为2—3d,细胞内含有棕黄色色素颗粒,随着细胞分裂,细胞内的色素颗粒稀释和变少。RT—PCR和细胞免疫组化检测,显示体外培养的人RPE细胞两种受体均有表达。结论人RPE细胞有多巴胺D2受体和腺苷A2A受体的分布。     

苏拉明对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的探讨苏拉明(suram in)对体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal p igm ent ep ithelium,RPE)细胞增殖的影响。方法不同浓度苏拉明(0.05、0.1、0.2、0.4g/L)作用于RPE细胞,采用生长曲线法及MTT比色法检测苏拉明对RPE细胞增殖的影响,台盼蓝染色检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期变化;透射电镜观察各浓度苏拉明作用后细胞超微结构变化。结果苏拉明对RPE细胞增殖有抑制作用(P<0.05),且呈时间剂量效应;流式细胞术检测示苏拉明将细胞阻滞于G2/M期(P<0.01);透射电镜结果示苏拉明浓度为0.05~0.2 g/L时,RPE细胞结构无明显变化,而苏拉明0.4g/L时,细胞表面微绒毛减少,染色质边集。结论苏拉明能够抑制体外培养的猪RPE细胞增殖,但随浓度增加,对细胞有潜在毒性作用。     

补体C5b-9复合物对人视网膜色素上皮细胞TGF-β_2表达的影响

目的 观察补体C5b-9复合物对人视网膜色素上皮(RPE)细胞TGF-β2表达的影响.方法 采用大鼠血清接触兔红细胞提取补体C5b-9复合物.提纯、鉴定后的补体C5b-9复合物作用于体外培养的人RPE细胞,用半定量RT-PCR法测量TGF-β2表达水平.结果 补体C5b-9复合物刺激质量浓度为80μg/mL和40μg/mL时,光学显微镜示REP细胞结构破坏;低于或等于20μg/mL时,光学显微镜未见REP细胞结构明显改变.20μg/mL补体C5b-9复合物作用RPE细胞4h后,TGF-β2 mRNA表达水平可提高2倍.结论 补体C5b-9复合物对RPE细胞的破坏作用有溶破量和亚溶破量之分,亚溶破量可诱导RPE细胞TGF-β2表达上调.     

腺病毒转导的胞嘧啶脱氨酶基因联合5-氟胞嘧啶对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究毒性基因联合前体药物对人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium, HRPE）细胞增殖的抑制作用，探讨防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的有效方法。 方法 分别将不同浓度胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)基因、5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5-FC)加入第3 代体外培养的HRPE培养液中，以x-半乳糖甘酶(x-galactosidae, X-gal)与基因乳糖操纵子(lac operon,Lac Z)标记CD基因，通过检测HRPE阳性感染率衡量腺病毒的转导效率。甲基四唑盐比色法(methylthiazolyl-terazollium,MTT)检测细胞的增殖抑制率。 结果 CD基因对HRPE的转染率呈剂量依赖性。CD基因转染阳性的HRPE细胞可将5-FC转变为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)，有效抑制体外培养的HRPE细胞增殖。本研究中所用的毒性基因联合前体药物治疗系统对RPE细胞生长无明显的旁观效应。 结论 腺病毒载体作为高效载体，可选择性将目的基因转入细胞中。为药物防治PVR形成提供了新思路。 （中华眼底病杂志，2003，19：168-171）     

可见光对体外培养兔视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

目的研究可见光对体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigmen tepithelium,RPE)细胞凋亡的影响。方法用两步酶法消化分离、培养并鉴定RPE细胞。RPE细胞分为对照组及实验组,实验组用(3652±213)Lux的白色荧光灯照射6h。分别于光照前及光照后3h、12h、24h、72h终止培养,取细胞行Bcl-2mRNA原位杂交检测,观察细胞Bcl-2基因表达情况。选取部分光照后24h组细胞进行透射电镜的观察。结果对照组各时间点Bcl-2mRNA原位杂交阳性细胞率无统计学差异(P>0.05)。实验组光照后3h阳性细胞率为(82.29±5.65)%,有轻度增高,但无统计学意义(P>0.05);光照后72h阳性细胞率为(44.07±7.11)%,光照后12h、24h、72h阳性细胞逐渐减少,均有统计学意义(P<0.05)。RPE细胞光照后透射电镜观察到染色质碎裂、凋亡小体等细胞凋亡的典型形态学变化。结论一定强度的可见光照射可引起体外RPE的凋亡。光照后一定时间内可以刺激并启动细胞自身的保护机制。     

苏拉明联合地塞米松对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:探讨苏拉明(suramin,Sur)联合地塞米松(dexamethasone,Dex)对体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的影响。方法:选择0.05,0.1,0.2,0.4g/L Sur单独作用及联合0.2g/LDex作用于RPE细胞4d,MTT比色法检测对RPE细胞增殖的影响;0.2g/L Sur和0.2g/L Dex分别作用于RPE细胞,流式细胞术检测细胞周期变化;Sur浓度为0.2g/L,0.4g/L及0.2g/L Sur联合0.2g/L Dex时,透射电镜观察细胞超微结构情况。结果:MTT比色法检测表明各浓度Sur对RPE细胞有抑制作用(P<0.05),呈剂量效应关系;0.2g/L Dex与各浓度Sur联合应用对RPE细胞的抑制率由单独应用Sur的16.0%,27.3%,40.5%,64.1%增至42.3%,52.1%,65.6%,78.8%。流式细胞检测提示Sur将细胞阻滞于G2/M期(P<0.01);Dex将细胞阻滞于S期(P<0.01)。透射电镜结果显示,Sur浓度为0.2g/L时,单独应用及联合0.2g/L Dex应用,RPE细胞结构无明显变化,而Sur0.4g/L时,细胞表面微绒毛减少,细胞核皱缩。结论:Sur联合Dex能有效抑制体外培养的RPE细胞增殖。     

培养大鼠视网膜色素上皮细胞5-HT2受体分析

利用培养大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞，我们观察了多种受体激动剂/拮抗剂对RPE细胞内第二信使磷酸肌醇(InsPs)水平的影响。结果表明，5-羟色胺(5-ht)及5-HT₂受体激动剂如α-甲基-5-羟色胺、Quipazinc、和DOI(1-[2.5-dimethoxy-4-iodopheny1]-2-aminopropane)均刺激大鼠RPE细胞[³H]-InsPs形成，5-HT₂刺激[³H]-InsPs形成的效应可被5-HT₂受体拮抗剂Katanaerin完全阻断，而5-HT₃拮抗剂MDL72222对之无阻断作用。5-HT₂的效应还可被蛋白激酶C激活剂PMA(4β-phorbol 12-myristate 13-acetate)部分抑制．结果清晰表明，在大鼠RPE细胞存在着与l旭ps信使通路相偶联的5-HT₂受体． （中华眼底病杂志，1994，10：80-83）     

EGF促进RPE细胞毒蕈碱受体诱导的磷酸肌醇形成：受体间交互作用分析

对培养人眼视网膜色素上皮（RPE）细胞磷酸肌醇（InsPs）水平的分析表明，Carbachol显著刺激RPE细胞InsPs水平的升高，且该效应可被阿托品所阻断，表明在人眼RPE细胞存在毒蕈碱受体。去甲肾上腺素、5-羟色胺、表皮生长因子（EGF）、异丙肾上腺素和NECA对InsPs基础水平无明显影响。异丙肾上腺素和NECA对Carbachol刺激InsPs的效应也无明显影响；但EGF显著促进Carbacol刺激人眼RPE细胞InsPs水平升高的效应。提示在人眼RPE细胞EGF与毒蕈碱受体之间存在有受体间交互作用。 （中华眼底病杂志，1994，10：220-222）     

人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的：建立人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的冻存和复苏方法。方法：根据慢冻速融的细胞冻存原则，将原代或传代1～2次培养的人RPE细胞，加入10%二甲基亚砜作为保护剂，液氮中冻存。复苏时将冻存细胞在60℃、2分钟内融化，用台盼蓝染色测定细胞存活率，用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色作细胞鉴定，每日计算细胞数以确定细胞生长曲线。 结果：经冻存复苏后的RPE细胞的存活率达90%，生长状态与对照组无差异，抗人角蛋白染色阳性，细胞对数生长期在1～4天，群体细胞倍增期约为1.55天。 结论：人RPE细胞液氮冻存可保持生物活性，复苏后生长良好，保持了细胞特征。这可提供细胞系，方便了体外实验，并可能作为RPE细胞移植治疗一些眼底病的细胞库。 （中华眼底病杂志，1997，13：157-159）     

地塞米松对低温冷冻后人视网膜色素上皮细胞游离Ca2+浓度的影响

目的：观察地塞米松对低温冷冻后视网膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)细胞内Ca²⁺浓度的影响。 方法：在一70°C条件下，冷冻RPE细胞30秒，分别加入40、60、100、150、200μg/ml的地塞米松后，应用Fura^-2/AM荧光负荷技术，测定RPE细胞Ca²⁺浓度。 结果：地塞米松在40μg/ml~60μg/ml浓度范围可使冷冻后RPE细胞内Ca²⁺增高18.6%～29.8%，在150μg/ml~200μg/ml可降低细胞内Ca²⁺浓度28.4%～35.2%。 结论；地塞米松对冷冻后RPE细胞内Ca²⁺的影响表现为双重作用，即低浓度的促进作用和高浓度的抑制作用，提示临床用药应在冷冻瞬间冲击治疗。 （中华眼底病杂志，1997，13：86-88）     

Effect of MCI-9042, a 5-HT2 receptor antagonist,on retinal ganglion cell death and retinal ischemia

The neuroprotective effect of MCI-9042 (Mitsubishi Pharma Corporation) was investigated on glutamate-induced retinal ganglion cell (RGC) death in vitro and on rat retinal ischemia in vivo. RGCs were purified from retinal cells isolated from 6-day-old Wistar rats and cultured in serum-free media. After application of 25 microM glutamate, the viability of RGCs treated with or without several serotonin 2 (5-HT(2)) receptor antagonists: MCI-9042, M-1 (a major metabolite of MCI-9042), ketanserin, and LY-53857; was evaluated by calcein-acetoxymethyl ester staining. Retinal ischemia was induced by intraocular pressure (IOP) elevation (130 mmHg, 50 min). Rats were intraperitoneally injected with MCI-9042 at a dose of 3, 30 mg/kg or base at 30 min before and just after ischemia-reperfusion. Retinal damages were evaluated by histology, morphometric analysis and electroretinograms (ERGs) recordings at 7 days after ischemia-reperfusion. 25 microM glutamate decreased the number of viable RGCs to about 60 to 65% of untreated RGCs. MCI-9042, M-1, ketanserin, and LY-53857 significantly reduced glutamate-induced RGC death at concentrations of more than 100 nM, 1 nM, 1 microM and 100 nM, respectively. Ischemia-reperfusion caused thinning of the thickness between the inner plexiform layer and the outer plexiform layer and attenuation of a-and b-waves in ERG recordings. The intraperitoneal injection of MCI-9042 significantly reduced morphological and functional damages in retinal ischemia. Our data demonstrate that 5-HT(2) receptor antagonists including MCI-9042 and M-1 have the neuroprotective effects in cultured RGCs and that MCI-9042 protects against ischemic retinal diseases.