核酸疫苗pVAX1-F的构建及瞬时表达

目的:构建仙台病毒核酸疫苗pVAXl-F,并在COS 7细胞中表达.方法:利用PCR法以仙台病毒cDNA为模板扩增出F基因,与pMD18-T连接,测序正确后用HindⅢ/EcoR Ⅰ双酶切,将F基因引入经同样酶切的pVAX1载体,构建pVAX1-F表达载体,用PCR法和双酶切法鉴定,并将此重组质粒通过脂质体介导转染COS 7细胞,流式细胞术检测抗原蛋白表达、RT-PCR法检测外源基因的表达.结果:经PCR法和酶切鉴定,目的片段大小与预期相符,经测序目的基因序列与GenBank(EF679198)公布结果一致.重组质粒pVAX1-F转染COS 7细胞72 h后,能够表达抗原蛋白,流式细胞术检测达到58.3%,与对照组3.6%比较差异具有显著性(P<0.01),且F基因mRNA明显表达.结论:成功构建pVAX1-F,并能够在COS 7细胞中瞬时表达,为仙台病毒F基因核酸疫苗进行免疫学评价奠定基础.     

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及初步鉴定

目的:构建大鼠Ⅰ型大麻素受体(CB1)真核基因表达载体,并检测其在细胞中的表达情况。方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出CB1基因片段,产物连接到p MD18-T载体上。阳性实验筛选出阳性克隆,经Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后,将其连接到载体pc DNA 3.1(+)中,构建质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1,脂质体转染原代人胚肾293细胞(HEK293细胞)。用Western blot实验鉴定细胞中CB1蛋白的表达,用免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法检测其在细胞中表达的部位。结果:采用RT-PCR成功获得大鼠CB1基因,PCR扩增得到1 500 bp左右的CB1基因片段,双酶切鉴定及DNA测序证实质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1构建成功。Western blot实验、免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法证实载体pc DNA3.1(+)-CB1能在HEK293细胞中表达,且表达产物主要分布在细胞膜表面和细胞质中。结论:构建的pc DNA3.1(+)-CB1表达载体能成功转入真核HEK293细胞,并在细胞膜表面和细胞质中表达CB1蛋白。     

基因疫苗的研究进展及临床应用

基因疫苗是近10年来发展起来的新型疫苗。自1990年Woff等发现直接肌肉注射裸DNA质粒,不经任何载体手段即可在肌细胞内获得有效表达蛋白以来,基因疫苗的研究不断深入。1993年Ulmer等率先应用流感病毒基因进行疫苗的研究,之后研究范围不断拓宽。目前基因疫苗的研究已涉及到病毒、衣原体、支原体、螺旋体、细菌、寄生虫以及癌症等诸多领域,一些基因疫苗的研究已处于Ⅰ/Ⅱ期临床研究阶段。基因疫苗与常规的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗以及     

变形链球菌表面蛋白真核表达载体pcDNA3-PAc的构建Ⅲ.变形链球菌表面蛋白PAc编码基因pac的体外扩增

目的 获取完整的变形链球茵表面蛋白PAc的编码基因pac。方法 建立扩增长片段目的基因的PCR反应体系，根据文献报道的pac核苷酸序列设计引物，使用通用缓冲液和高纯度的质粒pPC4l DNA为模板，经PCR扩增pac基因。结果 扩增产物经琼脂糖电泳和分子量鉴定，为单一的4．7kb条带。结论 成功地从质粒pPC4l DNA模板上扩增到全长4．7kb的完整pac基因，为下一步的防龋核酸疫苗的研究提供了物质基础。     

淋球菌L型的诱导与基因鉴定

用非高渗透压培养基培养具有多重耐药性的淋球菌菌株，观察其在培养基内自发或在抗生素作用下Ｌ型的形成情况以及淋球菌稳定Ｌ型的基因鉴定方法，探讨淋球菌Ｌ型的形成条件，生物学特性以及与慢性淋病的关系及其病原学诊断的问题。结果表明，淋球菌的多重耐药性菌株在不含血清的非高渗透压液体培养基内能够良好生长，并且能够自发形成Ｌ型或在高浓度羧苄青霉素的作用下形成Ｌ型。淋球菌Ｌ型的形态高度不规则，体积巨大但能够通过０．     

轮状病毒核酸疫苗的构建及免疫效果观察

将轮状病毒Ｇ１型Ｗａ株的ＶＰ７基因克隆到真核细胞表达载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）中，通过肌肉注射和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ及Ｆ１小鼠后，产生了抗轮状病毒Ｗａ抗体，其中Ｆ１小鼠的抗体反应答强于ＢＡＬＢ／小鼠，肌肉注射优于皮下注射。     

人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析

目的：克隆Survivin基因的cDNA，为分子信标定量检测其mRNA提供模板标准物。方法：以国人胎脾为材料提取总RNA作为模板，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增并克隆Survivin cDNA，并将其重组到pUCl8质粒中，用双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：克隆的Survivin cDNA序列与Gene Bank中的该基因序列相比较仅有1个碱基出现差别，并导致编码相应氨基酸的改变。结论：成功构建了Survivin基因的cDNA克隆，为建立Survivin基因mRNA的定量检测方法奠定了基础。     

TLR9基因敲除小鼠的构建及表型初步鉴定

目的构建TLR9基因敲除小鼠模型,并对其表型进行初步鉴定。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR9基因敲除小鼠;利用毛细管凝胶电泳技术鉴定敲除小鼠的基因型,并通过PCR产物测序分析对敲除效果进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot及免疫组织化学技术分别检测TLR9基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况;观察基因敲除小鼠的遗传性状、体重及血常规变化;并通过苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠组织的病理形态学变化。结果 PCR和测序结果表明TLR9基因敲除成功。敲除小鼠的脾、肝组织中TLR9基因mRNA及蛋白质水平表达显著低于野生型小鼠;TLR9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,体重、外周血血常规各项指标均正常。TLR9基因敲除小鼠各组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立TLR9基因敲除小鼠模型,为研究TLR9基因的生物学功能和调控机制提供实验动物模型。     

人胰岛细胞自身抗原69ku蛋白基因的分离及重组质粒鉴定

目的：应用聚合酶链技术获取作为基因探针和体外表达研究所必需的人胰岛细胞自身抗原６９ku蛋白（hＩＣＡ６９）编码基因,为探讨该基因在不同种系间和（或）组织来源间的差 异打下基础。方法：分别从正常白人胰腺细胞和国人胰岛细胞瘤Ｐoly（Ａ＾＋）－ＲＮＡ中逆转录合成编码人胰岛细胞自身抗原６９ku蛋白（hＩＣＡ６９）的全长cＤＮＡ,以双链cＤＮＡ（ds cＤＮＡ）为模板,经聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增出hＩＣＡ６９基因     

新型表位基因疫苗的构建及对小鼠黑色素瘤的影响

目的：构建以MAGE-1（161—169）为表位的癌症基因疫苗并检测其抗小鼠黑色素瘤效果。方法：构建基因疫苗pcDNA—HSP70-MAGE—l（161-169）,并免疫C57BL／6小鼠。最后一次免疫后第2周,接种小鼠黑色素瘤细胞。于肿瘤细胞接种后14d,处死全部动物,称量肿瘤的重量。采用ELISA法对小鼠血清中抗MAGE-1-IgG类抗体及小鼠原代脾淋巴细胞IFN-7释放水平进行检测。结果：pcDNA-HSP70-MAGE-1（161—169）表位基因疫苗能够成功地诱发机体产生抗MAGE-1的特异性抗体,并能在体内起到抗小鼠黑色素瘤作用,抑瘤率为40．7％。同时还能提高约3．05倍的小鼠原代脾淋巴细胞IFN-7释放量。结论：pcDNA-HSP70-MAGE-1（161-169）有望成为有效的抗小鼠黑色素瘤基因疫苗。     

仙台病毒HN基因真核表达质粒对幼鼠免疫效果的评价

目的：评价仙台病毒HN基因真核表达质粒pcDNA3.HN对幼鼠的免疫效果.方法：使用去内毒素的构建质粒肌内注射免疫幼鼠,设立阳性对照和阴性对照组,观察靶器官的变化和免疫应答效果.结果：仙台病毒HN基因可以很好地诱导实验小鼠的细胞免疫和体液免疫,能够很大程度地保护肺组织免受随后仙台病毒的攻击.结论：仙台病毒HN基因真核表达质粒良好的免疫效果为今后开发基因疫苗提供了理论和实践依据.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白核酸疫苗的构建及免疫观察

目的：构建用于防治单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）引起的生殖器疱疹的DNA疫苗。并探讨其免疫保护作用。方法：利用PCR法从HSV-Ⅱ Say株中扩增出gD糖蛋白基因的全部编码序列，将其插入pcDNA3中，构建HSV-Ⅱ gD核酸疫苗，用PCR法、酶切法和测序法进行鉴定；将重组质粒转染COS-7细胞，用原位ELISA检测表达产物；对BALB／c小鼠进行肌肉免疫，用微量细胞中和试验、ELISA、脾T淋巴细胞增殖反应和病毒攻击试验检测免疫效果。结果：构建的HSV-Ⅱ gD核酸疫苗具有良好的免疫原性，对小鼠具有保护作用。结论：本实验成功构建出了具有免疫防御效应的HSV-Ⅱ gD核酸疫苗。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的：探讨治疗性双质粒HBV DNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法：以脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000介导，将带有preS2＋S基因的重组疫苗质粒pS2，S和带有hIL2＋hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞，同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组，于转染后24，48，72，96h采用EL／SA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素（IL-2）及干扰素（IFN-1）的表达，并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性，采用ECL Western blotting分析和鉴定目的蛋白preS2＋S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果：双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达。且48h时目的蛋白的表达量达峰值，其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性，pS2．S和pFP的转染上清分别在30．6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论：HBVDNA疫苗质粒pS2．S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h，并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30．6ku和110ku。     

婴幼儿仙台病毒天津株感染的IgM抗体检测及意义

目的:通过对婴幼儿仙台病毒天津株感染的IgM抗体检测,了解人兽共患病原体——仙台病毒对婴幼儿急性下呼吸道的致病情况。方法:观察组为2006年冬季天津市儿童医院0～7岁首诊呼吸道感染患儿83例血清标本,通过间接免疫荧光检测法(IFA)排除了7种常见呼吸道病毒的感染,用自建的酶联免疫吸附法(ELISA)对仙台病毒的IgM抗体进行检测,同时设20例正常儿童血清标本为阴性对照组。结果:观察组16例为阳性,阳性率19.28%。与2004年同期数据44.59%(33/74)相比,本组阳性率有所降低,差异有统计学意义(P<0.01)。IgM抗体检测阳性率1岁内最高,1～3岁和3～7岁组阳性率基本接近,但3组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:仙台病毒在儿科急性呼吸道感染的病原体中占有一定的比例,不可忽视。应对其感染状况进行深入研究。     

HBsAgDNA疫苗诱导小鼠特异性细胞和体液免疫

目的：观察乙型肝炎病毒（HBV）S区DNA疫苗pCR3．1－S诱导BALB／C小鼠（H-2^d)的特异性免疫应答,及其对稳定表达HBsAg的小鼠肥大细胞瘤细胞P815（P815－HBV-S)成瘤性的影响。方法：肌肉注射DNA疫苗;背部皮下接种P815－HBV－S细胞,观察成瘤情况;ELISA法检测小鼠血清抗HBs;4h^41Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性。结果：pCR3．1－S 外可表达HBsAg;小鼠接肿该疫苗后血清450nmA值为0．38,强化免疫后达0．87;pCR3．1－S组CTL细胞杀伤活性为51．1％,对照组为20．5％（P＜0．01）。接种P815－HBV－S细胞后对照组成瘤率100％,pCR3．1－S小鼠成瘤率为16．7％,对照组小鼠6周后全部死亡;pCR3．1－S组6周后存活率为87．5％。结论：HBVS区DNA疫苗具有良好的免疫原性,能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答,对体内HBV感染具有预防及治疗作用。     

新型树突状细胞疫苗的构建及功能的初步鉴定

目的:构建可同时实现沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激和肿瘤相关抗原负载的新型树突状细胞(DC)疫苗。方法:构建沉默SOCS1并共表达HMGB1及肿瘤相关抗原NY-ESO-1的质粒(p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1)。体外诱导单核细胞分化为DC,将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞。同时设立未转染组、shNC/GFP转染组和p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组。PCR和Western blot验证基因及蛋白表达后,酶联免疫吸附(ELISA)法检测DC细胞分泌的肿瘤坏子因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-12、IL-1及IL-6的变化。结果:经测序证实所构建质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒结构正确。成功将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞,并在基因和蛋白水平验证NY-ESO-1的正确表达,HMGB1可在胞浆内表达。SOCS1 shRNA质粒shS可沉默SOCS1表达。p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组DCTNF-α、IL-12、IL-1及IL-6分泌量较未转染组和shNC/GFP转染组升高(P<0.05)。结论:成功构建可同时实现沉默SOCS1、HMGB1刺激和肿瘤相关抗原负载的新型DC疫苗。     

细胞介素融合蛋白质粒促进乙肝病毒DNA疫苗诱导的抗体产生

目的初步评价人白细胞介素融合蛋白质粒(pFP)以不同方式和剂量,联合乙肝DNA疫苗(pS2.S)1次性接种诱导健康小鼠体液免疫应答的效果,并探讨其作用机制.方法第1批分为pS2.S(10μg.只-1)与pFP(10μg.只-1)同时混合,于pFP后或前3日及分左、右侧胫前肌注射4种方式.第2批为不同剂量的pFP与一定剂量(10μg.只-1)的pS2.S混合共注射.第3批为不同剂量pS2.S与pFP按11混合共注射免疫实验.结果pFP与pS2.S混合共注射免疫效果最佳,以此方式改变pFP剂量联合pS2.S免疫2、4周时,血清抗-HBs阳性例数及水平以2者剂量按11配伍为最高,按此配伍免疫4周时,高(H)、中(M)、低(L)剂量组血清抗-HBs阳性率均为100%,而L组血清抗-HBs水平(51.1±23.8)mIu@ml-1均较M组(217.4±64.1)mIu@ml-1及L组(212.1±124.6)mIu·ml-1低,差异具有显著性(t=7.168,P＜0.01;t=2.838,P＜0.05).联合免疫接种2天后,分离采集各组10只小鼠局部引流淋巴结(LN),淋巴细胞及树突状细胞(DCs)计数结果,pS2.S+pFP组DCs密度及其占LN细胞的百分比均较pS2.S+pcDNA3.1组高.结论pFP与pS2.S剂量按11配伍混合共注射免疫效果最佳,pFP可能通过促进局部组织抗原呈递功能较强的DCs的增殖及活性而达到其佐剂效应.     

Vesicular Stomatitis Virus glycoprotein G carrying a tandem dimer of Foot and Mouth Disease Virus antigenic site A can be used as DNA and peptide vaccine for cattle

Effective Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) peptide vaccines for cattle have two major constraints: resemblance of one or more of the multiple conformations of the major VP1 antigenic sites to induce neutralizing antibodies, and stimulation of T cells despite the variable bovine-MHC polymorphism. To overcome these limitations, a chimeric antigen was developed, using Vesicular Stomatitis Virus glycoprotein (VSV-G) as carrier protein of an in tandem-dimer of FMDV antigenic site A (ASA), the major epitope on the VP1 capsid protein (aa 139-149, FMDV-C3 serotype). The G-ASA construct was expressed in the Baculovirus system to produce a recombinant protein (DEL BAC) (cloned in pCDNA 3.1 plasmid) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) and was also prepared as a DNA vaccine (pC DEL). Calves vaccinated with both immunogens elicited antibodies that recognized the ASA in whole virion and were able to neutralize FMDV infectivity in vitro. After two vaccine doses, DEL BAC induced serum neutralizing titers compatible with an “expected percentage of protection” above 90%. Plasmid pC DEL stimulated FMDV specific humoral responses earlier than DEL BAC, though IgG1 to IgG2 ratios were lower than those induced by both DEL BAC and inactivated FMDV-C3 after the second dose. DEL BAC induced FMDV-specific secretion of IFN-γ in peripheral blood mononuclear cells of outbred cattle immunized with commercial FMDV vaccine, suggesting its capacity to recall anamnestic responses mediated by functional T cell epitopes. The results show that exposing FMDV-VP1 major neutralizing antigenic site in the context of N-terminal sequences of the VSV G protein can overcome the immunological limitations of FMDV-VP1 peptides as effective protein and DNA vaccines for cattle.     

三种流感疫苗对H7N9禽流感病毒的免疫交叉反应

目的 评价季节性流感疫苗对H7 N9禽流感病毒的免疫效果.方法 使用3种季节性流感疫苗对受试者进行免疫接种,受试者于免疫前及免疫后21 d采集血样.应用微量血凝抑制试验(HI)对血清进行抗体检测.结果 在接种流感疫苗前,接种3种不同季节性流感疫苗的A、B、C组针对H7N9型毒株抗体几何平均滴度(GMT)均为血清1:5.0稀释阴性,保护抗体阳性率均为0.疫苗免疫后21 d,276例受试者中检测到6例受试者H7N9型毒株HI抗体结果 达到1:40阳转标准,阳转率为2.2%,A、B和C组各有2例(2.2%)、1例(1.1%)和3例(3.3%)H7N9型毒株HI抗体阳转.3组抗体阳转率差异无统计学意义(P=0.789).H7N9型抗体阳转率、GMT增长倍数、抗体保护率均未达到欧盟标准和美国食品药品管理局标准.结论 接种季节性流感疫苗不能为人群提供针对H7 N9禽流感病毒的免疫保护.