肝细胞生长因子基因转染大鼠急性脑卒中模型的生物效应

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）基因转染大鼠急性脑卒中模型后的表达情况及其生物学效应。方法39只实验用大鼠，线栓法制备成可控性急性大鼠脑卒中模型。利用基因重组技术将HGF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因标记的真核表达载体PIRES2-EGFP进行融合，构建真核细胞表达质粒。通过脂质体介导法，立体定向下多点注射到大鼠急性脑卒中模型的缺血半暗带区域行基因转染，转染7d后断头取大鼠脑组织，切片观察HGF基因在大鼠脑内的表达情况；并采用兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体对大鼠脑组织进行免疫组化染色，显微镜下随机检测5个高倍视野下缺血半暗带区血管数量；同时在基因转染前及转染后7d，应用CT灌注扫描对实验鼠脑血流量进行监测，观察基因转染对脑血流量的影响。将大鼠脑卒中模型随机分成3组（每组13只）：（1）注射脂质体／pIRES2-EGFP-HGF质粒的实验组；（2）注射脂质体/PIRES2-EGFP空载质粒的空载体对照组；（3）空白对照组（未进行注射）。结果酶切鉴定及基因测序证实，HGF基因片段已克隆到PIRES2-EGFP的BamH Ⅰ和SalⅠ位点之间。HGF基因转染大鼠缺血半暗带区7d后，利用荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达，用免疫组化方法进一步证实了HGF的表达。实验组大鼠转染局部血管数量（46．71±7．11）条／5个高倍视野，明显多于对照组的（20．43±3．21）条／5个高倍视野和空白对照组的（18．00±3．27）条／5个高倍视野（F=74．447；P＜0．01）；CT灌注显示其梗死侧大脑半球的脑血流量（63．82±6．08）％也高于对照组（53．58±4．19）％和空白对照组（52．46±4．93）％（F=10．445；P＜0．01）。结论脂质体转染HGF基因能够在缺血半暗带区表达，表达产物能够发挥生物学效应，促进局部血管侧支循环形成。     

320排动态容积CT全脑灌注成像在脑梗死缺血半暗带分期中的应用

目的 应用320排动态容积CT全脑灌注成像探讨脑梗死缺血半暗带分期的可行性.资料与方法 测量18例存在缺血半暗带脑梗死患者的梗死核心区、缺血半暗带区及其镜像对侧脑血容量(CBV)、脑血流量(CBF)、平均通过时间(MTT)及达峰时间(TTP),按脑梗死前期分期标准对缺血半暗带进行分期.结果 18例缺血半暗带区表现为MTT、TTP延长,CBF降低,CBV轻度升高、正常或轻度降低.与梗死核心区比较,缺血半暗带区CBV、CBF升高,MTT延长,TTP缩短(P＜0.05);与健侧对应区比较,CBF降低,MTT及TTP延长(P＜0.05),而CBV无显著差异(P＞0.05).缺血半暗带分期:Ⅰ2期3例,Ⅱ1期9例,Ⅱ2期6例.结论 应用320排动态容积CT全脑灌注成像可明确脑梗死患者的病变部位、范围以及有无缺血半暗带存在,并可对缺血半暗带进行分期.     

rAAV-CD 151基因在大鼠缺血后肢血管再生中的作用及血管造影评分

目的:研究肌肉转染重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的CD151基因在大鼠后肢缺血模型中促血管再生和血运重建的作用。方法:分别包装携带有CD151基因和GFP基因的重组腺相关病毒(rAAV-CD151,rAAV-GFP)。Wistar大鼠12只,随机分为实验组和对照组,每组各6只。实验组大鼠左下肢肌肉注射局部转染rAAV-CD151,对照组注射rAAV-GFP,基因转染2周后行股动脉切除术建立左侧大鼠后肢缺血模型。通过后肢血管造影和缺血肌肉组织毛细血管密度检测,观察缺血肢体血管再生和评价血运重建情况。Western blot检测两组大鼠局部缺血肢体CD151表达。结果:股动脉切除术4周(基因转染6周)后,后肢血管造影结果显示实验组缺血侧血管评分平均为2.56±0.37,对照组平均为1.57±0.39;实验组缺血后肢肌肉组织毛细血管密度为(609.00±83.89)/mm2,对照组为(517.00±70.65)/mm2;两组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示实验组大鼠缺血侧肌肉组织CD151表达为对照组的2.96倍。结论:局部高表达CD151基因能够提高缺血组织的血管再生能力,促进缺血组织的血运重建;CD151将为缺血性疾病的血管再生治疗提供新的靶点。     

CT灌注成像对脑梗死缺血半暗带的动态观察

目的：应用CT灌注成像（CTPI）诊断超急性期脑梗死，并对缺血半暗带灌注情况进行动态观察。材料和方法：26例发病时间在6h内临床怀疑脑梗死的患者进行头颅CT平扫及CTPI检查，测量病变区及镜像侧脑血流量（CBF）、脑血容量（CBV）、平均通过时间（MTT）及各个参数图异常灌注区面积，并计算相对脑血流量（rCBF）、相对脑血容量（rCBV）、相对平均通过时间（rMTT）。第一次扫描24h后复查CT平扫及CTPI。结果：第一次CT平扫示非责任的陈旧性脑梗死6例，其余20例均未见异常。CTPI示超急性期脑梗死20例，其中16例存在缺血半暗带；其余6例为TIA。复查CTPI示超急性期存在缺血半暗带的16例病例于急性期梗死区周围仍然存在低灌注区，与超急性期半暗带rCBF、rCBV及rMTT比较无明显差异（t分别为2，05，1．515，0．081；P〉0，05）。超急性期缺血半暗带区rCBF、rMTT与TIA低灌注区比较有明显差异（t分别为2，868，3，717；P〈0，05），而rCBV比较无明显差异（t=1．748；P〉0．05）。急性期梗死区面积平均1470，75mm^2较超急性期（1387mm。）增大，梗死区面积增加与缺血半暗带所占比例有线性相关关系（spearman相关系数1．00，P〈0．05）。结论：缺血半暗带不仅仅存在于脑梗死超急性期，在急性期亦可能有缺血半暗带的存在；CTPI不但能够早期诊断缺血性脑卒中，而且对不同发病时间病例是否存在缺血半暗带做出判断。     

16层螺旋CT脑灌注成像在急性脑梗死诊断中的应用价值

目的 探讨16层螺旋CT(MSCT)脑灌注成像对急性脑梗死的早期诊断价值.方法 对34例临床拟诊为急性脑梗死的患者行头颅CT平扫,脑CT灌注成像.评价脑CT灌注成像的达峰时间(TTP),脑血流量(CBF),脑血容量(CBV).全部病例3～7天内复查CT及临床随访.选取20名正常志愿者作为对照.结果 常规CT平扫显示:34例急性脑梗死患者在发病24h内,15例诊断为急性脑梗死,19例未见异常,后经复查CT及临床随访证实,2例为短暂性脑缺血发作(TIA),17例为急性脑梗死.脑CTP显示:34例急性脑梗死患者在发病24h内,32例脑CTP灌注异常,2例脑CTP灌注正常,脑CTP显示患者感兴趣区内脑血流量(rCBF)、脑血容量(rCBV)、对比剂达峰时间(rTTP)明显改变,病灶侧与对照侧、病灶中心区与周边区比较,差异有显著意义(P＜0.01).CT平扫的敏感度44.11％,特异度71.42％;CTP的敏感度94.11％,特异度100％.结论 脑CTP能够早期诊断急性脑梗死,定量分析可区分中心梗死区与缺血半暗带区,有助于临床医生早期选择治疗方案.     

天麻素注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响

目的研究天麻素注射液对大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡、脑组织梗死体积的影响。方法采用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,TUNEL及TTC染色法分别检测凋亡细胞数目及脑梗死体积。结果天麻素注射液组再灌注后24h凋亡细胞数目明显低于对照组(P<0.05),主要出现于大脑皮质及尾壳核病变中心区的周围,且脑梗死体积较对照组明显缩小(P<0.05)。结论天麻素注射液能显著抑制缺血半暗带细胞凋亡的发生,阻止脑梗死范围进一步扩大,对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,可能的作用机制是通过拮抗谷氨酸而阻断缺血再灌注后细胞凋亡。     

下调PTEN基因对全脑缺血再灌注大鼠神经元损伤的保护作用研究

目的 探讨下调第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)对全脑缺血再灌注大鼠神经元损伤的保护作用.方法 60只SD大鼠随机分为正常对照组(转染脂质体)、pshGFP组(转染pshGFP质粒)、pshRNApten治疗组(转染pshRNApten质粒),每组20只,各组分别于再灌注后3d(6只)、7d(7只)、14d(7只)三个时间点进行观察.正常对照组与pshGFP组分别注射脂质体与pshGFP质粒,pshRNApten治疗组于海马局部注射pshRNApten质粒.注射2d后,采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血再灌注模型.利用RT-PCR和免疫组化法检测海马神经元PTEN基因的表达;采用HE和Nissl染色检测神经元损伤情况;采用TUNEL法检测神经元凋亡情况.结果 pshRNApten治疗组海马神经元PTEN基因的mRNA和蛋白表达量均较正常对照组明显下降(P<0.05).pshRNApten治疗组海马神经元损伤和变性程度均明显轻于pshGFP组大鼠,海马TUNEL染色阳性细胞数也明显少于pshGFP组大鼠(P<0.05).结论 下调PTEN能有效缓解由缺血再灌注所致的神经元损伤.     

影像学在缺血半暗带诊断中的应用

急性脑梗死是脑血管疾病中的多发病,并有着较高的致死率及致残率,而对于疾病的早期诊断及干预,特别是对于缺血半暗带的及时救治能降低该病的致死率并改善其预后[1].对于缺血半暗带的检测,影像学技术是一种直观、易行的方法,传统的CT技术在缺血半暗带的检查已不能满足,而一些新的影像学技术如CT灌注、磁共振扩散及灌注、正电子发射断层显像(PET) -CT等逐渐成为研究的热点并运用到临床.笔者回顾急性脑梗死缺血半暗带的概念,总结常用的影像学方法的优缺点以及对于检测缺血半暗带的潜力.     

CT灌注成像对大鼠脑梗死半暗带的时间依赖性

目的：应用CT灌注成像对急性脑梗死缺血半暗带阈值进行判定,并着重探讨其时间依赖性。方法：取110只Wister大鼠,随机分为3组：对照组（10只）、缺血组（50只,分为5个亚组）、缺血再灌注组（50只,分为5个亚组）。用栓线法制作大鼠脑缺血动物模型,后2组于手术后5个时间点（2、4、6、8和10 h）分别行CT灌注成像检查,再灌注组经再灌注24 h后还需再次行CT灌注成像检查。检查结束后对图像进行判定,确定半暗带和最终梗死区的rCBF值,并取大鼠的脑组织进行病理观察。结果：缺血2 h和4 h的中心区及边缘区,缺血6、8和10 h的边缘区为半暗带,在缺血4 h之前,即使此区域的rCBF低至0.143,仍可逆;缺血6 h之后rCBF〉0.223以及10 h之后rCBF〉0.271的区域才有挽救的意义。病理检查显示在缺血6 h后,光镜和电镜发现有坏死神经细胞。结论：CT灌注成像能够判断半暗带及其阈值,预测其转归。在判断阈值应考虑到阈值与缺血时间的关系。     

CT灌注成像在脑梗死前期局部低灌注中的应用价值

目的: 探讨脑梗死前期局部低灌注的CT灌注成像的价值.材料和方法: 分析15例临床诊断为脑局部缺血CT平扫和CT增强扫描,常规MRI、MRA及CT灌注成像的表现.结果: 15例CT平扫和增强扫描均未发现新的脑梗死灶,CT灌注成像发现脑梗死前期脑局部低灌注I1期4例、I2期7例、II2期3例,MRI发现缺血灶14个,MRA发现一侧大脑中动脉狭窄2例,一侧大脑中动脉闭塞1例.结论: 脑梗死前期局部低灌注,常规CT,MRI无异常发现.CT灌注成像可超早期发现脑组织局部血流动力学异常,并可分期区分低灌注的脑局部微循环的病理生理学状态,对临床治疗有重要价值.     

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的 从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1（KGF-1）编码区序列,构建真核荧光表达载体.方法 从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录 PCR获取KGF-1 cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定.将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞（marrow stroma cells,MSCs）48 h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致.KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内.结论 成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础.     

阿片受体δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2δEGFP),并实现其在CHO细胞中的表达.方法 以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-FLAG-pIRES2-EGFP载体转染CHO细胞,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测δ-FLAG的表达.结果 测序及酶切结果表明获得了带FLAG标签的δ基因,成功构建δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光.应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 成功构建了δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达.     

Comparison of perfusion computed tomography with diffusion-weighted magnetic resonance imaging in hyperacute ischemic stroke

OBJECTIVE: In this study, perfusion CT and diffusion-weighted magnetic resonance imaging (DWI) were compared as means of assessing the ischemic brain in hyperacute stroke. METHODS: Twenty patients with ischemic stroke underwent perfusion computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI) studies <3 hours after stroke onset. Cerebral blood flow thresholds were used to delineate the ischemic lesion, penumbra, and infarct. Correlations between the volume of the hypoperfused areas, the abnormality volume in admission DWI and follow-up CT/MRI studies, and the clinical National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) scores were performed. RESULTS: The volume of the ischemic (core and penumbra) lesion on admission perfusion CT was correlated with the volume of admission DWI abnormalities (r=0.89, P=0.001). The infarcted core tissue volume (on admission CT) correlated more strongly (r=0.77, P=0.0001) than the admission DWI abnormality volume (r=0.69, P=0.002) with the follow-up infarct volume on fluid-attenuated inversion recovery images. A correlation was demonstrated between infarct volume in perfusion CT and follow-up DWI abnormality volume (r=0.89, r=0.77, P=0.002). Significant correlations were found between ischemic and infarct region volumes in perfusion CT and NIHSS admission and follow-up scores (P < or = 0.01). CONCLUSIONS: Both imaging modalities provide a sufficient assessment of the hyperacute brain infarct, with significant correlation between them and the clinical condition at admission. Perfusion CT allows differentiation of the penumbra and infarct core region with significant predictive value of follow-up infarct volume and clinical outcome.     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

EGFP标记的VEGF165重组质粒的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建pIRES2-EGFP-VEGF165真核表达质粒,并在大鼠骨髓间充质干细胞内表达。方法应用DNA重组方法构建pIRES2-EGFP-VEGF165,并将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞内,采用ELISA和MTT法检测转染后细胞培养上清液中VHGF165的含量及生物活性。结果成功构建了pIRES2-EGFP-VHGF165,将其转染骨髓间充质干细胞后,VEGF蛋白表达水平明显增高．转染后的细胞培养上清具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-VEGFl65．将其转染骨髓间充质干细胞后可高水平地表达具有生物学活性的VEGF蛋白。     

320排动态容积CT全脑灌注成像技术在脑梗死中的临床应用

目的:探讨320排动态容积CT全脑灌注成像技术在脑梗死诊断中的优势及临床应用价值。方法:对42例脑梗死患者行CT全脑灌注成像,一次对比剂注射得到平扫容积图像、CT血管成像图像及全脑灌注图像,综合运用这三种检查方法全面评估脑梗死。结果:42例脑梗死患者共发现18例存在缺血半暗带(IP),其中8例超急性期6例存在IP,19例急性期8例存在IP,15例亚急性期4例存在IP。42例梗死核心区与健侧对应区比较,脑血容量(CBV)、血流量(CBF)、平均通过时间(MTT)及达峰时间(TTP)值差异均具统计学意义(P<0.05)。18例IP区与梗死核心区比较,CBV、CBF、MTT及TTP值差异均具统计学意义(P<0.05),与健侧对应区比较,CBV值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:急性期及亚急性期脑梗死仍可能存在IP。应用320排容积CT全脑灌注成像,对脑梗死患者可明确其责任血管的狭窄部位及程度,了解病变范围及有无IP存在,实现对脑梗死的全面评估。     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.     

真核表达载体pIRES2-EGFP-p93的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达

目的 :构建肿瘤抑制基因DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO - 8910中 ,并得到稳定表达。方法 :利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段 ,将其正向连接入真核表达载体pIRES2 -EGFP ,并通过酶切鉴定。用脂质体介导的方法 ,将真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93转染人卵巢癌细胞系HO - 8910 ,通过G4 18筛选稳定表达克隆 ;分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察人DOC - 2蛋白在卵巢癌细胞系HO - 8910中的表达。结果 :构建了DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,并通过酶切鉴定。在荧光显微镜下 ,转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910发出绿色荧光 ,荧光全部集中于胞浆内。免疫细胞化学染色结果显示转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910胞浆呈棕黄色 ,而转染空载体的细胞呈阴性染色。结论 :成功构建了真核表达载体转染了pIRES2 -EGFP -p93,并在人卵巢癌细胞系HO - 8910中稳定表达 ,为研究DOC - 2蛋白对卵巢癌细胞的作用奠定了基础