小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因1对人胶质瘤U251细胞增殖侵袭的影响

目的 探讨小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因l (PTTG1)对人胶质瘤U251细胞增殖侵袭的影响及可能机制。方法 设计靶向沉默PTTG1的siRNA,将U251细胞随机分为PTTG1基因沉默组、阴性对照组和空白组,PTTG1基因沉默组U251细胞转染PTTG1-siRNA,阴性对照组细胞转染无关序列,空白组细胞不转染任何序列。转染后继续培养48 h,采用real-time PCR与Western blot方法鉴定转染结果,MTT方法和transwell实验分别检测细胞的增殖能力与侵袭能力,Western blot方法检测U251细胞中p-Akt、基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)的表达。结果 PTTG1基因沉默组U251细胞中PTTG1 mRNA和蛋白表达显著低于阴性对照组和空白组（P<0.01）,结果提示转染成功。与空白对照组及阴性对照组比较,PTTG1基因沉默组U251细胞活力显著降低,侵袭能力显著降低,p-Akt、MMP-2/9的表达显著降低（P<0.01）。结论 沉默PTTG1基因可以抑制U251细胞的增殖和侵袭,PTTG1有望成为胶质瘤靶向治疗的新靶点。     

RNA干扰EP—CAM基因表达对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：利用RNA干扰技术抑制人胆囊癌GBC-SD细胞中上皮细胞黏附分子（EP-CAM）基因的表达,探讨抑制EP-CAM基因后对GBC-SD细胞增殖、凋亡的影响.方法：构建靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒,转染GBC-SD细胞,用RT-PCR和Western Blot分别检测EP-CAM基因的mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果：靶向EP-CAM的miRNA重组质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1构建成功,重组质粒能显著抑制靶基因EP-CAM的mRNA及蛋白表达.与对照组比较,干扰后的细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）,但细胞增殖活性受到明显抑制（P＜0.05）.结论：靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒能有效抑制EP-CAM基因的表达,抑制GBC-SD细胞的增殖.     

RNA干扰SHBG基因表达对滋养细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制SHBG基因表达对滋养细胞增殖的影响。方法在体外通过RNA干扰技术,将SHBG si RNA转染至原代培养的人绒毛滋养细胞中,MTT法检测滋养细胞增殖情况。结果成功将SHBG si RNA转染人绒毛滋养细胞;转染后24、48、72h,SHBG si RNA转染组的细胞生长速度显著减缓,正常对照组(未经转染的细胞)、空白对照组(只转染脂质体,无si RNA)和阴性对照组(转染非特异性si RNA)的组间比较差异均无统计学意义(P0.05);转染组(SHBG si RNA-I,SHBG si RNA-II,SHBG si RNA-III)之间差异均无统计学意义(P0.05),各转染组分别与各对照组的组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 si RNA可以有效干扰人绒毛滋养细胞SHBG基因的表达,抑制滋养细胞增殖的增殖活性。     

RNA干扰对胶质瘤细胞垂体瘤转化基因影响的实验研究

目的构建表达靶向抑制PTTG基因的表达短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体。方法根据PTTG基因cDNA序列,设计针对PTTG基因的3组干扰序列,并设计1组阴性对照序列,克隆到真核表达载体pGenesil-1中,进行酶切鉴定和测序鉴定。将构建好的4组重组质粒分别命名为PTTG-1组,PTTG-2组,PTTG-3组、阴性对照NC(negativecontrol)组。利用RNA干扰技术,将以上shRNA分别转染细胞中,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PTTGmRNA表达水平、Western blot检测PTTG蛋白表达水平。结果构建的PTTG RNA干扰序列和阴性对照序列经基因测序证明序列正确。细胞在转染PTTG干扰载体后,提取细胞的总RNA,经RT-PCR电泳发现,在转染24 h后,PTTG-2、PTTG-3即显示出抑制作用,PTTGmRNA表达水平降低,PTTG-1组对目的基因的抑制作用不明显;在转染48 h后,各组均显示出抑制作用,但PTTG-3的抑制作用更明显;转染72 h后,PTTG-1组有微弱的抑制作用,PTTG-2及PTTG-3组仍有显示明显的抑制作用,但PTTG-3抑制作用较PTTG-2更强烈。Western blot检测不同时间PTTG蛋白的变化显示,在转染24 h后,PTTG-1、PTTG-2、PTTG-3组对目的基因的抑制作用均不明显;在转染48 h后,PTTG-1、PTTG-2、PTTG-3组均显示出抑制作用,但PTTG-3的抑制作用更明显;转染h小时后,PTTG-1组没有抑制作用,PTTG-2及PTTG-3组仍有显示明显的抑制作用,但PTTG-3抑制作用较PTTG-2更强烈。结论成功构建了靶向抑制PTTG基因的表达短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,并筛选了干扰效果最强的序列,为进一步实验打下了基础。     

RNA干扰致基因表达沉默细胞模型的建立

目的探讨siRNA和shRNA在基因功能研究中的应用。方法用化学方法合成siRNA,以及用常规的分子克隆方法构建shRNA表达载体。以人类K562细胞为实验对象,采用lipofectamine将MDM2基因的siRNA和shRAN表达载体导入细胞后,用多重RT鄄PCR和Westernblot检测目标基因MDM2的表达水平。结果K562细胞瞬时转染MDM2siRNA48h后,MDM2蛋白质表达下降超过60%;稳定转染shRNA表达载体后,MDM2基因在mRNA和蛋白质表达水平下降超过70%。实验结果表明成功地建立了MDM2表达下调的实验细胞模型。结论siRNA和shRNA都能有效地导致目标基因表达沉默,在基因功能研究中瞬时转染和稳定转染需要配合使用以获得更理想的实验结果。     

Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的测定Survivin特异小干扰RNA(siRNA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响。方法构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株。用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRNA表达载体。Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降。MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01)。结论Survivin特异siRNA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡。     

RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR（Real-time PCR）检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3 d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V（Annexin V）染色并用流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74%;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加。 结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡。     

NEDD9在神经胶质瘤中的表达及基因沉默对人胶质瘤U251细胞增殖与侵袭的影响

目的研究NEDD9在神经胶质瘤中的表达及NEDD9基因沉默对人胶质瘤U251细胞增殖与侵袭的影响。方法选取手术切除的脑胶质瘤组织36例及正常脑组织10例,采用qRT-PCR和Western blot法检测各组脑组织中NEDD9mRNA和蛋白表达情况,构建靶向NEDD9的shRNA重组慢病毒载体,将慢病毒载体转染U251细胞,应用qRT-PCR与Western blot方法检测NEDD9mRNA与蛋白表达,MTT方法检测转染后U251细胞活力的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果脑胶质瘤组织NEDD9的蛋白与mRNA表达水平显著高于正常脑组织。成功建立了稳定沉默NEDD9基因的U251细胞株,与空白对照组及阴性对照组比较,转染NEDD9-shRNA组U251细胞活力与侵袭能力显著降低(P0.01)。结论 NEDD9可能是治疗胶质瘤U251细胞的潜在靶点。     

金雀异黄素对胶质瘤细胞株U251MG凋亡的影响

目的 研究金雀异黄素(Genistein)对人胶质瘤U251MG细胞凋亡的影响及机制.方法 碘化丙啶(propidium iodide,PI)和Annexin V-FITC双染色的流式细胞分析方法检测凋亡,并通过流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测Bcl-2、bax蛋白的表达.结果 Genistein在25 μg/ml和50 μg/ml作用48 h后,早期凋亡率均较对照组明显增加(P<0.01),并呈剂量依赖性.Bcl-2蛋白表达较对照组明显下降(P<0.01),而bax蛋白则较对照组明显增加(P<0.01),呈剂量依赖性.结论 Genistein可诱导胶质瘤U251MG细胞凋亡,其机制可能与其上调bax蛋白以及下调Bcl-2蛋白的表达有关.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

RNA干扰抑制乙酰肝素酶对肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨抑制乙酰肝素酶表达对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 构建靶向人乙酰肝素酶基因短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达质粒(pshRNA-Hpa),用脂质体将其转入A549细胞,建立稳定转染细胞株系,经逆转录.PCR和Western blot法检测转染效率后,分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell侵袭实验和流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染法)检测其对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.采用Western blot法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB/Akt-Ser473)的表达.结果 转染pshRNA-Hpa的A549细胞乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达明显低于未处理A549细胞,抑制率分别为54.09%和48.26%,细胞增殖速度减缓,侵袭能力降低,流式细胞术显示早期细胞凋亡率达(12.53±0.34)%,较空白对照组、空载体转染细胞组和阴性对照组明显增加(P＜0.01).同阴性对照质粒相比,转染pshRNA-Hpa的A549细胞Akt-Ser473的磷酸化水平降低52.15%.结论 靶向乙酰肝素酶重组shRNA质粒pshRNA-Hpa能有效抑制A549细胞乙酰肝素酶的表达,并可能通过下调磷酸化蛋白激酶B途径抑制细胞的增殖侵袭、促进细胞的凋亡.     

Knockdown of NPM1 by RNA interference inhibits cells proliferation and induces apoptosis in leukemic cell line

Nucleophosmin (NPM1) is an abundant and ubiquitously expressed phosphoprotein that is known to influence solid tumors progression. However, little is known about the role of NPM1 in leukemia. Here, we knocked down the NPM1 expression by RNA interference to investigate the role of NPM1 in leukemic cells proliferation and apoptosis. The interference vector pNPM1-shRNA was constructed and transfected into the human leukemic K562 cell line. The expression levels of NPM1 mRNA and protein were detected by quantitative real-time PCR and Western blot, respectively. Cells proliferation potential in vitro was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and colony formation assays. Flow cytometry was used to detect the distribution of cell cycle. Cellular apoptosis was reflected by the relative activities of caspase-3 and caspase-8. The results showed that the expression levels of NPM1 mRNA and protein in K562 cells were significantly reduced after pNPM1-shRNA transfection. The cells growth was significantly inhibited in a time-dependent manner and the number of colonies was significantly reduced in the pNPM1-shRNA transfected cells. Meanwhile, the percentage of cells in G1 phase in the K562/pNPM1-shRNA cells was significantly increased. In addition, there were higher relative activities of caspase-3/8 in the pNPM1-shRNA transfected cells. These results indicate that down-regulation of NPM1 expression inhibits leukemic cells proliferation, blocks cell cycle progression and induces cellular apoptosis. It may implicate a potential target for leukemia gene therapy.     

二氢杨梅素对肺癌A549细胞凋亡的作用

目的 探讨二氢杨梅素（DMY）对肺癌A549细胞的诱导凋亡作用。方法 以肺癌A549细胞为研究对象,采用MTT法研究DMY对A549细胞的抗肿瘤作用,并进一步通过流式细胞术检测DMY对A549细胞的凋亡作用,免疫印迹法（Western blotting）检测促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2表达水平,进一步探讨其机制。
结果 DMY浓度越大,对A549细胞的抑制作用越明显,48h的IC50为64.45g/L;流式细胞术显示,随着DMY浓度的增加A549细胞凋亡也逐渐增加;Western blotting结果显示,DMY可诱导A549细胞中凋亡因子Bax蛋白表达增加,同时抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达减少,尤其高浓度组改变明显。
结论 DMY可以在体外诱导A549细胞凋亡。     

膜联蛋白A5低表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖与凋亡的影响

目的 观察宫颈癌细胞系HeLa细胞在膜联蛋白A5表达降低后,细胞增殖和凋亡的情况. 方法 采用BNA干扰的方法,通过免疫印迹法筛选出对HeLa细胞中膜联蛋白A5的表达抑制效率最高的siRNA,脂质体法将siRNA转染入细胞48h后,用MTT法检测细胞增殖的改变情况,用细胞凋亡光学检测试剂盒检测细胞的凋亡.结果 Helm细胞中膜联蛋白A5的表达被显著抑制,其增殖速度与未转染siRNA的普通HeLa细胞相比,无显著性差异;细胞凋亡显著减少,与未转染siRNA的普通HeLa细胞相比,有显著性差异. 结论 膜联蛋白A5低表达对宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖未见显著影响,但可能影响了细胞的凋亡.     

靶向hTERT RNA干涉促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的：利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达，探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法：将成功构建的针对hTERT的siRNA(small interferencing RNA)表达载体转染HeLa细胞，通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细胞的凋亡情况。结果：构建的siRNA表达载体可以诱导HeLa细胞发生凋亡。结论：针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体稳定转染HeLa细胞，可诱导HeLa细胞发生凋亡。     

针对B7-H1的siRNA对脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的:利用针对B7-H1的siRNA在脑胶质瘤U87细胞中下调B7-H1的表达,研究B7-H1的表达下调对U87细胞增殖和凋亡的影响。方法:根据人B7-H1的mRNA序列设计并合成两对针对B7-H1的siRNA,于转染前一天将U87细胞接种于10 cm细胞培养皿中,以转染时细胞融合度为50%-80%为宜,分别用250μl OPTI-MEM稀释15μl siRNA与15μl转染试剂Lipofectamine 2000,将两者混匀室温静置20 min后,滴入细胞培养皿中。转染60或72 h后利用流式细胞术检测B7-H1在细胞表面的表达情况,利用荧光定量PCR和Western Blot分别检测B7-H1的mRNA和蛋白质水平,并用MTT和流式细胞术检测B7-H1表达下调后,U87细胞增殖和凋亡的改变。结果:与阴性对照组相比,两对针对B7-H1的siRNA均可有效下调U87细胞中B7-H1的表达,流式细胞术结果显示与阴性对照组相比,B7-H1阳性表达率由53.2%分别下调至26.7%和20.6%;MTT结果显示B7-H1表达下调后U87细胞的增殖被显著抑制,培养第5天吸光度值由0.58±0.02分别下降至0.451±0.02及0.342±0.016;流式细胞术结果显示B7-H1表达下调后U87细胞凋亡明显,早期凋亡率由0.1%分别增加至12.8%及13.2%。结论:B7-H1的表达下调可有效抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖,并促进细胞凋亡,提示B7-H1可能作为脑胶质瘤基因治疗的一个潜在靶点。