重组CHO细胞中不同启动子对含MAR表达载体转基因表达的影响

目的 分析在重组CHO细胞中不同启动子对含核基质结合区(MAR)表达载体转基因表达的影响.方法 PCR扩增CMV启动子及β-珠蛋白MAR,构建含β-珠蛋白MAR表达载体pCAT1,随后将CMV启动子替代pCAT1上SV40启动子构建CMV启动子驱动的表达载体pCAT2.pCAT1、pCAT2不含MAR的对照载体同时转染CHO细胞,G418筛选稳定转化的细胞株,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的表达水平.结果 含MAR表达载体转染的细胞CAT酶表达量比不合MAR的pCATG和pCAT3载体转染的细胞高,分别提高2.14倍和1.25倍(P＜0.05);而由SV40启动子驱动含MAR表达载体pCAT1转染的细胞CAT酶表达水平明显比由CMV启动子驱动的pCAT2载体高3.26倍(P＜0.05).结论 在稳定重组CHO细胞中MAR能够提高转基因的表达水平,SV40启动子与MAR组合其启动效率优于CMV启动子与MAR组合.     

人β-珠蛋白核基质附着区介导表达载体稳定附着于中国仓鼠卵巢细胞

目的研究人β-珠蛋白核基质附着区是否能够介导表达载体稳定附着于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。方法人β-珠蛋白MAR序列克隆到pEGFP-C1构建重组质粒载体pEGFP-MAR,转染CHO细胞,使用Hirt裂解法提取细胞中附着体质粒,CaCl2法转化附着体质粒到宿主大肠杆菌DH5ɑ中,提取质粒,酶切,测序分析。结果还原质粒双酶切和单酶切结果均与转染前质粒酶切结果一致;测序分析得知还原质粒与转染前质粒中插入片段DNA序列相同。结论人β-珠蛋白MAR序列重组载体在CHO细胞中以附着体形式被完整还原出来。还原质粒酶切结果和测序结果均与转染前质粒一致。     

人β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响

目的:研究人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)在不同表达宿主中对转基因表达的影响.方法:通过PCR从人基因组扩增β-珠蛋白MAR,正向克隆至pCAT3-control载体SV40启动子的上游,分别检测在瞬时及稳定表达的情况下,MAR在NIH3T3及Hela细胞中对CAT报告基因的影响情况.结果:在瞬时表达情况下,NIH3T3细胞及Hela细胞中MAR均不能提高CAT基因的表达;在稳定整合的情况下,NIH3T3细胞中β-珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,而在Hela细胞表达水平只提高2.5倍.结论:MAR能在一定程度上提高稳定外源基因的表达水平;MAR的作用与表达宿主相关.     

不同启动子和MAR组合对重组CHO细胞转基因表达的影响

目的 分析不同启动子与核基质结合区（MAR）组合对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中转基因表达的影响。方法 将β-珠蛋白MAR(gMAR)与人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、猿猴空泡病毒40（SV40）启动子组合,构建两种不同启动子与gMAR组合的表达载体。转染CHO细胞,48 h后观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的瞬时表达情况;G418筛选稳定转化的细胞株,流式细胞术分析稳定CHO细胞eGFP基因的表达水平,实时荧光定量PCR（qPCR）分析eGFP基因的相对拷贝数。结果 不含gMAR的表达载体,CMV-IE启动子eGFP表达明显强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子eGFP表达水平,但在SV40启动子中并未表现出提高作用。两侧含gMAR的表达载体比一侧含有gMAR的表达载体CMV-IE启动子eGFP表达荧光强;G418加压筛选后,含SV40启动子的gMAR表达载体eGFP基因表达不稳定,荧光逐渐减弱,因此,后期只对稳定表达eGFP基因的CMV-IE启动子表达载体进行流式细胞术和qPCR分析。流式细胞术检测结果显示,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因表达量比不含gMAR的表达载体分别提高9.85倍和12.94倍;qPCR结果显示,以不含gMAR的载体的eGFP基因拷贝数为1,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因相对拷贝数为3.68和9.25。结论 CMV-IE启动子活性强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子外源基因的表达水平,其机制可能与增加基因拷贝数相关。     

含dMAR真核表达载体的构建及影响EGFP表达的研究

目的　研究dMAR对EGFP基因表达的调控作用。方法　用Kpn -I酶切pGFP/MAR,回收含MAR下游850bp的片段dMAR,与Kpn I酶切回收的pEGFP-C1 载体连接,Hind Ⅲ酶切鉴定方向,构建正向、反向连接的真核表达载体pEGFP/dMAR′和pEGFP/dMAR。将该表达载体转染COS7细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达并采用流式细胞术进行荧光定量。结果　pEGFP- C1,pEGFP/dMAR′和pEGFP/dMAR转染后48 h EGFP的表达量分别为45.1%、40.5%和11.3%。结论　pEGFP/dMAR显著抑制了EGFP的表达,pEGFP/dMAR′的增强表达作用不明显。     

MT启动子控制的GFP基因在CHO细胞中的诱导表达

用羊金属硫蛋白(MT)启动子构建含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达载体,经脂质体介导在培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行诱导性表达。结果:构建的GFP基因表达载体能在CHO细胞中进行表达,用硫酸锌诱导可提高GFP的表达量。     

稳定表达犬转铁蛋白受体CHO细胞系的建立和鉴定

目的 构建犬转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）的真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,建立稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。方法 从犬腺细胞系（WRD）提取总RNA,逆转录合成 cDNA,采用PCR方法扩增TfR 基因,将其克隆至真核表达载体pCDNA3,酶切和测序鉴定;利用脂质体法转染CHO细胞,通过RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR的表达。结果 构建的pCDNA3-TfR 重组质粒经过酶切和测序鉴定,TfR 基因序列成功插入到pCDNA3载体,且无突变。转染CHO细胞后,RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR表达阳性,成功建立了稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。HTH]结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3-TfR ,并获得了稳定表达TfR的CHO-TfR 细胞系。     

真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70的构建与鉴定

目的 构建癌胚抗原（CEA）与热休克蛋白70（HSP70）的真核双表达质粒，并检测其在体外的表达。方法 从结肠癌及正常肝组织中经RT-PCR扩增获得CEA及HSP70 cDNA，并将其定向克隆至真核双表达质粒pIRES中，重组质粒pIRES-CEA及pIRES-CEA-HSP70，经酶切及测序鉴定后，分别转染仓鼠卵巢细胞（CHO）；经RT-PCR及ELISA法检测，CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结果 真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70构建成功且CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结论 真核表达载体pIRES-CEA-HSP70的成功构建为治疗CEA阳性肿瘤提供一定的实验基础。     

富含GC的DNA片段对中国仓鼠卵巢细胞中转基因表达的影响及其位置效应

目的分析富含GC的DNA片段对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中转基因表达水平的影响及其位置效应。方法人工合成富含GC的DNA片段,将其克隆到表达载体的表达盒的5'、3'端及两端,构建在载体不同位置插入富含GC DNA片段的3个新表达载体(p IRES-G1、p IRES-G2和p IRES-G3),分别转染CHO细胞并用荧光显微镜进行观察;对照载体为p IRES-EGFP。采用G418筛选稳定细胞株,流式细胞术分析增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测其转基因拷贝数。结果成功构建了在载体不同位置含有GC DNA片段的3个载体,瞬时及稳定转染结果显示,在载体表达盒两端及3'端插入富含GC DNA片段能够明显提高EGFP在CHO细胞中的表达水平。与对照载体比较,稳定表达情况下载体表达盒两端及3'端插入富含GC DNA能分别提高转基因表达水平约1.39、1.32倍,而在5'端插入富含GC DNA片断对于提高基因表达水平作用尚不明显。表达盒两端及3'端插入富含GC DNA片段的转基因拷贝数比对照载体提高了约1.32、1.24倍。结论富含GC的DNA片段在CHO细胞提高转基因表达与其在载体上的位置有关,在载体表达盒两端或3'端插入一段富含GC的DNA片段可以提高转基因表达水平。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

Targeted Expression and Secretion of Human Apoprotein AI,Apoprotein E and Lecithin-choles-terol Acyltransferase from Myogenic Cell

Objective To investigate the possibility of heterologous expression for apoAI, apoE and LCAT by skeletal muscle cells and secretion into blood and to develop a safe and convenient gene therapy method for atherosclerosis. Methods Viral and nonviral vectors containing apoAI, apoE or LCAT genes were constructed and transfected into myogenic cells in vitro or injected directed into mouse skeletal muscle. The expression efficiencies of these vectors were investigated by ELISA assay for human apoAI and apoE3 and by the proteoliposome method for human LCAT. Genomic DNA was extracted from stable transduced myoblasts and analyzed for the presence of vector sequence by PCR amplifications. Immunocytochemistry assay was also performed to make an intuitionistic detection for the expression of transgene in myoblasts. Results All viral or nonviral vectors constructed in present study expressed the transgenes efficiently in mice skeletal muscles in vivo or cultured myoblasts in vitro. The transgene expression level of cells transfected with AAV-based plasmid vectors were 2-4 times higher then that of cells transfected with conventional plasmid vectors. Additionally, cells transfected with AAV-based bicistronic vector or tricistronic retroviral vector expressed both human apoAI and LCAT simultaneously. The sequences of retroviral or AAV-based plasmid vectors were found to be retained in host cells after transfection when that of conventional plasmid vectors were lost. Furthermore, transduced myoblasts maintained the ability for heterologous expression of human apoAI and LCAT even after differentiation into myotubes. For cells transfected with retroviral vectors, stable transduced clones can be selected by G418 and continued to efficiently express human apoAI and LCAT for 3 months. Conclusion These finds indicated that mice skeletal muscles or cultured myoblasts transduced with viral or non-viral vectors could efficiently express and secret human apoAI, apoE and LCAT. It suggested that the use of nonviral, adenoviral or AAV-based vectors to directly inject into skeletal muscle or the use of polycistronic retroviral to genetically modify myoblasts ex vivo and then implantation back to skeletal muscle to high efficiently and long-term express apoAI, apoE and LCAT in vivo might be a safe and feasible strategy to prevent or reduce the formation of atherosclerotic lesions.     

人胰岛素样生长因子-1的真核表达及其生物学功能研究

目的构建人胰岛素样生长因子1(IGF-1)分泌型真核表达载体,并检测表达产物的生物活性.方法从人肝细胞克隆IGF-1基因,并将其连入Psec Tag/FRT/V5-His载体,用脂质体法转染CHO细胞,将转染细胞上清培养骨髓基质干细胞,用MTT法测定骨髓基质干细胞的增殖情况.结果成功扩增210bp的IGF-1基因,表达产物经SDS-PAGE分析及Western bolt检测具有7.7KD特异性条带.骨髓基质干细胞的增殖随转染细胞上清的浓度、转染细胞上清培养时间的增加而增加.结论成功构建分泌型IGF-1真核表达载体,其表达产物对骨髓基质干细胞具有促增殖作用.     

Targeted Expression and Secretion of Human Apoprotein AI, Apoprotein E and Lecithin cholesterol Acyltransferase from Myogenic Cells

Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄｉｔｓｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｃｃｏｕｎｔｆｏｒｍｏｓｔｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ.Ａｎｕｍｂｅｒｏｆｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｄｅｍｏｎ ｓｔｒａｔｅｄａｎｉｎｖｅｒｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｍａｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ (ＨＤＬ)ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ[1 ] .Ｉｔｉｓｗｉｄｅｌｙａｃ ｃｅ…     

CYP3A4内含子10对CYP3A4基因表达的增强子作用

目的 探讨CYP3A4内含子10及其内SNP CYP3A4*1G对CYP3A4基因表达的调控作用.方法构建CYP3A4启动子启动转录的CYP3A4真核表达质粒, 将CYP3A4内含子10 (CYP3A4*1G野生型/突变型) 正向或反向插入该质粒的启动子上游, 从而构建出不同基因型、不同方向的CYP3A4内含子10调控的CYP3A4真核表达质粒.将构建好的各质粒分别转染入Hep G2细胞, 应用实时荧光定量PCR方法检测CYP3A4 m RNA表达水平.结果 构建的重组质粒经酶切验证与测序鉴定, 插入片段的序列和方向与预期完全一致.无论CYP3A4*1G野生型还是突变型, 反向组CYP3A4 m RNA表达水平均高于正向组 (P<0.01) ;而CYP3A4内含子10无论是正向还是反向, CYP3A4*1G野生型组CYP3A4 m RNA表达水平均高于突变型组 (P<0.01) .此外, 正向突变组CYP3A4 m RNA表达水平低于阳性对照组, 不但没有增强CYP3A4启动子的转录作用反而有所减弱.结论CYP3A4内含子10有类似于增强子的功能, 能够影响CYP3A4启动子对CYP3A4基因的转录, 且具有方向性和CYP3A4*1G等位基因依赖性.     

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能.方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达.Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型.     

人纤维介素基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人纤维介素（hfgl 2）基因的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达。方法：提取人外周血单个核细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，以其为模板，PCR扩增hfgl 2 cDNA片段，将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3．1，将重组质粒转染CHO细胞并制作细胞爬片，对爬片进行免疫组化染色，显微镜下观察并摄片。结果：扩增出1．3kb的目的片段，并将其克隆至pcDNA3．1，经酶切鉴定和测序鉴定无误；重组质粒转染CHO细胞，细胞爬片免疫组化染色可见细胞质中存在明显的阳性棕染。结论：成功构建hfgl 2基因的真核表达载体，为进一步探讨其功能学和干预研究奠定了基础。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。