结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。     

结核分枝杆菌Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的克隆结核分枝杆菌hspx(acr、Rv2031c)基因,扩增后测序,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白Hsp16.3(Heat Shock Protein16.3)。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出hspx基因片段,连接进入pTA2载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProEX HTb并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白SDS-PAGE分析后,分别与6×His mAb、16k Da mAb和结核病人血清进行Western-blot,最后用Ni-NTA进行亲和层析纯化蛋白。结果获得结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白基因,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量与文献报道一致;Western-blot结果显示,在相对分子量约16kDa处有与6×His mAb和鼠抗16k Da mAb的特异性结合带,而与结核病人血清杂交没有出现结合带。表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白。结论成功地表达、纯化和鉴定了Hsp16.3蛋白,它有可能作为新型结核疫苗的靶抗原。     

结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因,酶切,克隆至PGEM-TEasy质粒,测序确定插入片段的正确性,再克隆至表达载体pET30a中,并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导,表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因,构建了重组表达质粒,得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,纯度〉90%。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白,可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础。     

结核分枝杆菌Rv1884基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的　克隆表达结核分枝杆菌Rv1884基因 ,序列测定正确后进行融合表达、纯化。方法　采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1884编码基因 ,用限制性内切酶消化后插入到pGEM Teasy中 ,序列测定正确后 ,再亚克隆到融合表达载体 pPro EXHT中 ,转化大肠杆菌DH5α ,目的基因经IPTG诱导 ,由T7启动子调控表达了氨基端带 6个连续组氨酸残基的Rv1884蛋白 ,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果　获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1884蛋白基因 ,得到融合 6个组氨酸残基的Rv1884蛋白纯度大于 85 %。结论　构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的重组表达载体 ,并获得了高纯度的融合表达蛋白 ,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因，酶切，克隆至PGEM—TEasy质粒，测序确定插入片段的正确性．再克隆至表达载体pET30a中，并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导，表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因，构建了重组表达质粒，得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，纯度〉90％。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白，可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础．     

结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB Hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白稳定表达细胞系的建立

目的构建了表达结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的P815细胞系。方法将Hsp65与IL-2基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒Hsp65-IL-2-pcDNA3.1。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB/c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。G418筛选抗性克隆,免疫荧光检测融合蛋白的表达。结果真核质粒转染的阳性克隆细胞,经RT-PCR检测到Hsp65与IL-2融合蛋白mRNA水平的表达,分别用抗Hsp65和IL-2的单抗进行间接免疫荧光检测,可在转染重组质粒的P815细胞膜上观察到较强的绿色荧光。结论获得表达Hsp65与IL-2融合蛋白的稳定细胞系,为其CTL研究提供了合适的靶细胞。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。