人骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷

背景：目前已有将体外培养的骨髓基质细胞与支架复合修复骨缺损的临床报道。但是由于该类复合材料中缺乏骨生长因子作用，在原位的成骨作用并不十分理想。 目的：探讨携带人骨形态发生蛋白2基因的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷材料在修复兔颅骨缺损中的原位成骨作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-02/2008-11在辽宁医学院解剖学实验室完成。 材料：生物活性玻璃陶瓷由中国科学院四川成都光电研究所提供，转人骨形态发生蛋白2和转pcDNA3载体的骨髓间充质干细胞由辽宁医学院解剖学教研室骨组织工程研究所保存。 方法：制备兔双侧颅骨骨缺损模型，将基因转染的骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养物植入骨缺损区，术后第4,8,12周对植骨区进行大体观察、X射线摄片、组织切片、组织化学检测。 主要观察指标：①复苏后的转染人骨形态发生蛋白2的骨髓基质细胞的生长特性。②从大体、X射线结果和组织学等方面观察复合材料在原位修复骨缺损的作用。 结果：转染的骨髓基质细胞在细胞形态及增殖特性方面与未转染的细胞无明显差异。扫描电镜显示基因转染的骨髓基质细胞在生物活性玻璃陶瓷表面呈星形紧密排列，长入生物活性玻璃陶瓷孔隙中。复合材料植入免颅骨缺损后，X射线观察术后第4周骨缺损外周骨质与复合材料之间大部分被高密度阴影充填，术后第12周骨缺损外周骨质与复合材料之间完全被高密度阴影充填；光镜观察术后第8周骨小梁大部分相连成片，术后第12周骨小梁粗大，骨髓再生。 结论：基因转染的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷材料基本符合骨组织工程学的要求，在骨缺损区原位具有良好的成骨作用。 关键词：骨髓基质细胞；基因转染；生物活性玻璃陶瓷；骨缺损     

VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究**☆

背景：血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段。但是，血管内皮生长因子价格昂贵，并且半衰期非常短，很难在体内保持有效的作用浓度。故本实验将其转入组织工程的种子细胞——骨髓间充质干细胞中，使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子，从而达到促进血管生成的目的。 目的：探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。 设计：观察对比实验。 单位：吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所。 材料：实验于2003-06/2004-08 在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室（生物安全实验室二级）完成。健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供。4.0~5.0 月龄，体质量215~315 kg，雌雄兼用，实验过程中对动物处置均在麻醉状态、无菌条件下完成，符合动物伦理学标准。实验药品及试剂：Ham F12 培养基( GIBCO公司)，噻唑蓝(MTT) ( Sigma 公司)，pLXSN-KDRp-VEGF165 与pcDNA3.0 载体由本实验室自备, ELISA 检测试剂盒(深圳晶美生物公司)，感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH I、Xho I、HandIII、EcoR I 和标准DNA 分子( Promega 公司) 。 方法：分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞。构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165 真核表达载体，利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞，采用ELISA 方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达，MTT 法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0 转染骨髓间充质干细胞组为对照组。 主要观察指标：①重组质粒双酶切和基因测序分析。②ABC-ELISA 法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达。③通过MTT 法检测人血管内皮生长因子165 基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响。 结果：①构建的质粒用Hind III 和Xho I 双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同，PCR 和酶切鉴定正确后行测序鉴定，测序结果正确，证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165 重组质粒。②ABC-ELISA 法检测结果表明，人血管内皮生长因子165 基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h，即有较高水平的人血管内皮生长因子165 蛋白表达，48 及72 h 呈下降趋势，但与对照组比较，差异显著( P < 0.05) 。③MTT 法检测人血管内皮生长因子165 基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响，结果显示，含2%, 4%, 8%, 16%和32%转染人血管内皮生长因子165 基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组 ( P < 0.05) 。 结论：人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中，并可进行有效地表达。     

温度敏感型骨髓间充质干细胞的构建

目的 构建温度敏感型永生化的骨髓间充质干细胞( tsSV40LTag - BMSCs).观察不同温度条件下,tsSV40LTag - BMSCs的增殖情况.方法 分离、培养大鼠原代骨髓间充质干细胞(BMSCs),FITC标记CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗体,CD34单克隆抗体荧光标记大鼠BMSCs,流式细胞仪检测其表面标志.pRNS -1质粒转染BMSCs以及阳性克隆的筛选和扩增.RT - PCR检测BMSCs中tsSV40LTag的表达.测定33℃和37C两种温度下,tsSV40LTag - BMSCs生长曲线.结果 成功构建tsSV40LTag - BMSCs.33℃时,tsSV40LTag - BMSCs生长增殖速度较快,在体外培养条件下可连续传代增殖;37℃时,细胞生长增殖速度明显减慢,甚至停止生长.结论 tsSV40LTag- BMSCs的成功构建,为其移植治疗颅脑创伤奠定了实验基础.     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景：国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况。 方法：选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1~2)、生理盐水组(L2~3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3~4,L4~5,L5~6)。空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25 μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109 L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25 μL。移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量。 结果与结论：绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞。移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P < 0.001)。提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活。     

转染AKT1基因的自体骨髓间充质干细胞移植治疗猪缺血性心肌病☆

背景：干细胞移植早期出现的大量细胞缺失可明显影响移植效果,目前已证实AKT1基因的过表达能明显抑制细胞凋亡。 目的：探讨过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞移植能否在体内缺氧状态下抑制干细胞凋亡,及其修复受损心肌的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-08/2007-02在苏州大学完成。 材料：健康雄性梅山猪24只,由苏州大学动物实验中心提供。 方法：扩增AKT1 cDNA基因,并构建表达载体。扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,以其为载体转染建立稳定过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞,并行BrdU标记。24只猪均应用明胶海绵栓塞冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,造模后4周,随机均分为4组：模型对照组不做任何治疗性处理;DMEM组行冠脉内注射DMEM液5 mL;单纯细胞移植组行冠脉内注射骨髓间充质干细胞悬液5 mL(1×107个细胞);AKT转染细胞移植组同法注射等量转染AKT1基因的 骨髓间充质干细胞悬液。 主要观察指标：载体酶切鉴定和测序验证结果,心脏磁共振检查评估心功能,免疫组化染色观察心肌组织学变化,ELISA法测定血清中血管内皮生长因子及转化生长因子β1的水平。 结果：①双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的cDNA为AKT1的CDS功能区基因;转染入293T细胞和骨髓间充质干细胞24,48 h后,均可检测到强荧光出现;其蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符,实时荧光定量检测结果表明转染2周后的骨髓间充质干细胞能稳定转录AKT1,其AKT1-mRNA的转录水平是原代细胞的120倍。②细胞移植前,梗死心脏的左室舒张末径增加,每搏量明显下降。与移植前比较,移植后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心功能明显改善,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善,左室腔缩小,梗死区的毛细血管密度明显增加,且AKT转染细胞移植组上述各指标改善更为显著(P < 0.05)。③苏木精-伊红染色结果显示,模型对照组、DMEM组梗死区纤维化明显;单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组梗死区均可见岛样心肌组织,且后者含有较丰富的小血管样结构。免疫组化染色结果显示,移植4周后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心肌切片中均发现有VWF及Cx-43阳性表达,且后组Brdu和Cx-43双阳性细胞占所有Brdu阳性细胞的比例明显高于前组(P < 0.05)。④细胞移植后,血管内皮生长因子水平呈逐渐升高的趋势,1周后达峰值,后逐渐下降,至4周后接近正常水平;而转化生长因子β1水平呈逐渐下降的趋势,至4周后明显低于同期模型对照组、DMEM组(P < 0.05),且明显低于移植前水平(P < 0.05)。 结论：使用携带目的基因AKT1的慢病毒系统转染猪骨髓间充质干细胞可使其长期稳定过表达AKT1,移植体内后可能通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能,同时AKT1的过表达可显著改善梗死后心脏功能。     

骨髓间充质干细胞在软骨缺损修复中的应用

学术背景：骨髓间充质干细胞由于其易于获取,并可以在体外短期内大量扩增,是目前最有希望应用于软骨组织工程的干细胞。 目的：对骨髓间充质干细胞在软骨缺损修复中的应用状况进行综述。 检索策略： 由该论文的研究人员应用计算机检索1982-10/2006-12 Pubmed数据库与骨髓间充质干细胞修复软骨缺损相关文献，检索词“Marrow; Mesenchymal stem cells；cartilage defect”，限定语言种类为English, 同时检索1982-10/2006-12 中国科技成果数据库检索词“骨髓；间充质干细胞；软骨缺损”，并限定文章语言种类为中文。共检索到126篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①综述类及实验类文章；②中文核心期刊收录文献。排除标准：重复性研究。 文献评价：文献的来源主要来自Pubmed数据库及中国科技成果数据库。文献类型为综述类及实验研究。 资料综合：骨髓间充质干细胞在体内具有分化产生软骨的能力已被证明,而在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程,目前调控机制仍不明确。动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的骨和软骨缺损。虽然近年来对骨髓间充质干细胞及其在软骨组织工程方面的研究已取得较大进展,但对骨髓间充质干细胞分化各阶段细胞标志物、骨髓间充质干细胞的增殖、分化的控制及基因转染技术及临床应用的评估结果都有待进一步研究。 结论：动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的骨和软骨缺损，虽然近年来对骨髓间充质干细胞及其在软骨组织工程方面的研究已取得较大进展,但对骨髓间充质干细胞的基础和临床研究中仍存在诸多问题需要解决。     

骨髓间充质干细胞移植修复肾损伤

背景：研究发现外源性骨髓间充质干细胞能够定居于肾脏并且分化为肾脏细胞，参与损伤肾组织的修复，但对其修复作用途径尚无公认。 目的：探讨外源性骨髓间充质干细胞移植对肾损伤的可能治疗作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验，于2007-03/09在南昌大学泌尿外科研究所完成。 材料：清洁级SD大鼠56只。雄鼠8只用于制备骨髓间充质干细胞，雌鼠48只随机分为细胞移植组、模型对照组、假手术组，16只/组。荧光染料DAPI为Biotium Inc产品，蓖麻血凝素为Vector Laboratories产品，BrdU为Sigma产品。 方法：以密度梯度离心法分离鼠骨髓间充质干细胞，加入DAPI进行标记，调整细胞数为1.5×1010 L-1。细胞移植组、模型对照组建立缺血再灌注肾损伤模型，假手术组开腹后不予结扎肾血管。缺血45 min后，细胞移植组经下腔静脉注入用DAPI标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL，模型对照组、假手术组输入1 mL无菌生理盐水。移植后各组每天腹腔注射BrdU，其后留取血标本和肾组织。 主要观察指标：荧光显微镜及免疫组织化学染色观察移植细胞在肾组织中的分布，采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素鉴定移植细胞的分化，以免疫组化方法检测Brdu反映肾组织细胞的增殖状况，检测血清肌苷、尿素氮水平。 结果：移植后第3天可见少量DAPI阳性细胞，第4天DAPI阳性细胞数明显增加（P < 0.05），且多数DAPI标记细胞能结合蓖麻血凝素，DAPI阳性细胞主要分布于肾脏外髓质肾小管中，肾皮质和内髓质阳性细胞很少，而肾小球内则未见DAPI阳性细胞。假手术组肾组织细胞增殖非常弱，移植后第4天Brdu阳性细胞数明显低于模型对照组（P < 0.05）；移植后第2，3，4天细胞移植组Brdu阳性细胞均明显多于模型对照组（P < 0.05），其分布类似于DAPI阳性细胞。与模型对照组比较，细胞移植组大鼠血清尿素氮水平移植后第1，2天明显降低（P < 0.05）；细胞移植组大鼠血清肌苷水平移植后第1，2，3天均显著降低（P < 0.05）。 结论：移植的外源性骨髓间充质干细胞能够迁移、定居于缺血再灌注损伤后的肾组织中并分化为肾小管上皮细胞；骨髓间充质干细胞移植可促进损伤肾脏本身的细胞增殖再生；对肾损伤后早期肌苷、尿素氮的升高具有一定抑制作用，这种早期对肾功能的保护与其迁移定居到肾脏局部、分化修复损伤的肾小管无关。     

生物衍生骨与骨髓间充质干细胞复合修复兔桡骨大段缺损

背景：生物衍生支架材料具备与自身骨相似的结构和微环境,具有较好的应用前景。 目的：探讨生物衍生骨复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞修复兔桡骨的节段性骨缺损的可行性,并与单纯生物衍生骨进行比较。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成。 材料：同种异体骨经脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等方法处理后制备生物衍生骨支架材料,与自体骨髓间充质干细胞复合制备组织工程骨支架材料。 方法：25只健康成年新西兰大白兔双侧桡骨制备中段15 mm的骨缺损,随机取其中20只兔右侧桡骨为实验组植入组织工程骨,左侧为对照组植入单纯生物衍生骨,不做内外固定;另5只兔双侧骨缺损处不植入任何材料作为空白组。 主要观察指标：应用X射线放射学检查及组织学观察比较3组骨缺损修复的能力。 结果：X射线显示随时间延长骨折处骨痂逐渐增多, 实验组8周基本愈合,12周塑形完成;对照组骨痂少,愈合时间推迟;空白组术后12周骨缺损未见骨性修复,最后形成骨不连。术后2,4,8,12周实验组放射学检查评价新骨生成优于对照组 (P < 0.05)。组织学检查显示实验组术后4周时材料开始吸收,8周基本降解吸收被新生骨取代,12周完全修复;对照组明显推迟,新骨生成速度、生成量低于实验组(P < 0.05);空白组各时点均无新骨形成,最后缺损由纤维组织充填。 结论：成骨诱导的间充质干细胞／生物衍生骨复合构建组织工程化骨植入修复兔桡骨缺损能够加速新骨形成,其修复能力明显优于单纯生物衍生骨。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。 目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。 设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。 方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。 结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

人骨髓间充质干细胞及其在脑缺血的应用

近年来研究发现人骨髓间充质干细胞在适宜的条件下可向神经细胞分化,并对脑缺血性疾病的神经功能缺损有明显的改善作用。本文就人骨髓间充质干细胞的取材来源、分离培养、细胞表面标记、神经细胞方向分化潜能及其在脑缺血性疾病应用方面的研究进展作了综述。     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景：以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度。基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破。 目的：进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复。 方法：从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中。实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞。术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况。 结果与结论：体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生。透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨。透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组。组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组。提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复。     

重组骨形成蛋白2/壳聚糖磷酸钙支架载体与经诱导骨髓间充质干细胞共培养的可行性★

目的：观察经诱导的骨髓间充质干细胞在由重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2）修饰后的壳聚糖-磷酸钙支架材料上的增殖和生长情况，以及其作为成骨细胞的支架载体用于构建组织工程化骨的可行性。 方法：实验于2007-02/08在暨南大学附属第一医院中心实验室及暨南大学理工学院材料科学与工程系实验室完成。①制备壳聚糖-磷酸钙支架，再将其放入rhBMP-2溶液中浸泡30 min，真空抽吸后冷冻干燥。②测量改良后壳聚糖-磷酸钙支架的孔隙率及抗压强度，扫描电镜观察其超微结构；同时，将兔骨髓间充质干细胞接种于复合支架上，用成骨细胞诱导液培养1周，扫描电镜观察成骨细胞在支架上的生长及黏附情况。 结果：①rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体的孔径超过100 μm，空隙率为87%，压缩弹性模量为20 MPa。②扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构，孔内见有细胞生长，细胞表面可见分泌颗粒。 结论：经复合rhBMP-2后的壳聚糖-磷酸钙支架是合适三维立体多孔复合支架，有较好的细胞相容性，可以作为成骨细胞的支架载体，用于构建组织工程化骨。     

端粒酶催化亚单位基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的利用端粒酶催化亚单位基因(h TERT)异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(h MSCs)系。方法使用含有h TERT的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经新霉素G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定。结果转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型。细胞免疫组化染色显示有h TERT的表达。结论成功地构建了h TERT永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较**☆

背景：有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高,目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。目的：观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨活性的差异,探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。方法：经脂质体转染分离培养的兔BMSCs,G418筛选出稳定表达株,利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况;以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体,转染兔BMSCs,MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力;以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs 7 d后,测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平,观察成骨活性的变化。结果与结论：实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7;RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%;转染BMSCs后,细胞增殖能力均明显提高,BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7 d后,细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,骨钙素水平升高,成骨活性均增强;两种基因比较,BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P < 0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高,对BMSCs均有成骨活性,其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景：小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。 目的：观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。 方法：制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。 结果与结论：实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组(P < 0.01),且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

聚乳酸-乙醇酸共聚物-磷酸三钙-骨形态发生蛋白2人工骨结合肌肉移植修复骨缺损

背景：大段骨缺损修复多以植骨为主,如果能将带血运的组织与人工骨同时植入,理论上更有利于新生组织血运建立及人工骨的爬行替代重建。 目的：观察聚乳酸-乙醇酸共聚物-磷酸三钙-骨形态发生蛋白2人工骨结合自体带血供自体肌肉移植修复大段骨缺损的效果。 方法：手术造成30 mm绵羊大段桡骨缺损,抽签随机分为3组：实验组植入聚乳酸-乙醇酸共聚物-磷酸三钙-骨形态发生蛋白2人工骨及自体带血运的屈指长肌,对照组仅植入聚乳酸-乙醇酸共聚物-磷酸三钙-骨形态发生蛋白2人工骨,空白对照组未植入任何材料。3组均以钢板固定骨缺损区,术后24周进行X射线检测及组织学观察。 结果与结论：实验组桡骨缺损处完全成骨修复,皮质骨与髓腔轮廓清晰,骨痂为较成熟板层骨;对照组骨缺损基本完全修复,但新生骨密度及髓腔轮廓清晰度及骨痂成熟度均不如实验组;空白对照组无有效骨痂形成,缺损区被大量纤维组织填充。说明聚乳酸-乙醇酸共聚物-磷酸三钙-骨形态发生蛋白2人工骨结合自体带血供肌肉移植能够很好修复绵羊桡骨30 mm的大段骨缺损。     

体外构建腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石的植骨材料

背景：随着组织工程和基因工程技术迅速发展,基因增强的组织工程骨为临床治疗骨缺损带来美好的前景。 目的：观察经腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2表达载体(Ad-BMP-2)转染后的兔骨髓间充质干细胞在纳米羟基磷灰石植骨材料上的黏附、增殖及骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：用Ad-BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞,免疫组化、蛋白印迹法检测转染后细胞内骨形态发生蛋白2的表达情况。将转染48 h的细胞均匀接种到纳米羟基磷灰石植骨材料上,扫描电镜观察细胞黏附状况,并采用MTT比色法测定骨髓间充质干细胞的增殖情况;消化收集黏附植骨材料上第3,5,7天的细胞,蛋白印迹检测黏附材料上细胞骨形态发生蛋白2的表达。 结果与结论：转染后,骨髓间充质干细胞内骨形态发生蛋白2有高表达;扫描电镜见转染细胞在纳米羟基磷灰石材料孔隙周围及孔隙内黏附生长良好并大量增殖,MTT分析结果显示,纳米羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞的体外增殖无抑制作用,复合后骨形态发生蛋白2有较高表达。结果表明经Ad-BMP-2转染后的骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石植骨材料生物相容性好,细胞在材料上能稳定长效地分泌骨形态发生蛋白2。     

血管内皮细胞生长因子/骨形态发生蛋白2联合修饰骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死

背景：将血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白二者联合修复坏死骨,有可能在保持种子细胞成骨表型的同时,又能持续高效地分泌血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2,从而有效促进血管再生,促进组织工程化骨组织的形成和再血管化。 目的：观察血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2体外修饰骨髓间充质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死效果。 方法：建立兔右侧股骨头缺血性坏死模型,并以抽签法随机分为3 组：单纯髓芯减压组、髓芯减压+骨髓间充质干细胞组、髓芯减压+血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞组。关节镜监视下将坏死骨清除,组织学检查成骨及血管生成情况。 结果与结论：通过关节镜观察显示各组坏死骨清除干净,有新鲜血流出。组织形态学检测发现,髓芯减压+血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞组移植后不同时间点血管数量及修复区新骨面积比显著高于单纯髓芯减压组、髓芯减压+骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。提示血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2基因转染加强了骨髓间充质干细胞成骨作用,提高了新生骨的数量与质量,加快了股骨头缺血性坏死的修复。     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：研究表明，骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性，但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂，且众说纷纭。 目的：观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。 设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成。 材料：6周龄SPF级SD大鼠10只，体质量140~160 g，雌雄不拘，用于间充质干细胞的获得、培养和传代。重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品。 方法：将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组：重组人骨形态发生蛋白2组：加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2；音猬因子组：加入20 μg/L音猬因子；联合组：100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞；对照组：不加任何干预措施。 主要观察指标：倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化；MTT法检测细胞培养第3，6，9，12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性；以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析，以比较各组诱导成骨能力的差异。 结果：①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁，贴壁细胞呈圆形或椭圆形，第7天左右细胞铺满瓶底，多为梭形。条件培养基培养3 d后，联合组细胞由长梭形转变为多角形。随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变，音猬因子组细胞未见明显形态学改变。②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P < 0.05)。联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P < 0.05)。③间充质干细胞经诱导培养7 d后，碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性，联合组可见胞质中棕黄色颗粒，音猬因子组和对照组阴性。诱导培养14 d后，Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性，但联合组细胞数量明显增多，细胞间融合较好，重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳。矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性，联合组细胞间可见红色的钙结节。④蛋白免疫印迹分析显示，与对照组相比，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加，联合组尤其明显，音猬因子组与之接近。 结论：骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性。