腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：研究ｐ５３基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒ｐ５３和顺铂联合作用于人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９，对ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ａｄ－ＬａｃＺ进行复组腺病毒转导效率的检测，发现当ＭＯＩ为１００以上时，重组腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９细胞被传导，用ＲＴ－ＰＣＲ方法，在胆管癌ＱＢＣ３９细胞系中ｐ５３无表达。重组体腺病毒能介导外源基     

腺病毒介导多基因对胆管癌细胞凋亡的诱导和肝细胞毒性损害

目的 研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２）对胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９凋亡的诱导作用和对正常肝细胞的作用。方法 应用ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检查法和光镜观察，分析同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－、ｐ５３、ＩＬ－２４种目的基因的重组腺病毒载体（Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ）对胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９和肝细胞系Ｌ０２的作用以及对大鼠肝脏的毒性损害。结果 Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ与化疗药     

CD自杀基因联合GM-CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理

目的：研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机制。方法：小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３ｄ后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续１０ｄ腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）、单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组、单用ＡｄＧＭ－ＣＳＦ组、注射对照病毒ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ组或ＰＢＳ组。结果：与接受ＡｄＣＤ／５ＦＣ、ＡｄＧＭ－ＣＳＦ、ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ或ＰＢＳ治疗的荷瘤小鼠比较,经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制,荷瘤小鼠的存活期明显延长（Ｐ＜０．０１）。经ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ联合基因治疗后,肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、ＣＤ８＋Ｔ细胞浸润,黑色素瘤细胞表达ＭＨＣ－Ⅰ和Ｂ７－１分子明显增加,荷瘤小鼠脾细胞对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论：联合应用自杀基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞,又可提高机体对肿瘤的免疫应答,两者可协同发挥抗肿瘤作用。     

腺病毒介导多基因在胆管癌细胞中的表达

研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ,Ｂ７－１,ｐ５３、ＩＬ－２）在胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９中的表达及对其生长的影响。方法：构建同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ,应用流式细胞仪、ＥＬＩＳＡ、免疫组化等方法。     

急性白血病细胞p53基因表达

目的：检测急性白血病细胞内ｐ５３基因表达情况。方法：３Ｈ－ｄＡＴＰ标记基因探针的斑点杂交。结果：急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）表达ｐ５３ＲＮＡ水平与正常对照类似，急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）中５９．４％表达低水平ｐ５３或表达缺失，ｐ５３表达缺失在Ｍ４、Ｍ５中多见。结论：急性白血病细胞中存在ｐ５３ＲＮＡ表达异常。     

腺病毒介导的野生型p53基因表达对入胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨恢复野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建一个Ｅ１区缺失但能表达ｗｔｐ５３基因的５型腺病毒载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，该载体含有人ＣＭＶ启动子、人野生型ｐ５３基因和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号。载体经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染人胰腺癌ＰＣ－２细胞。ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实，转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的表达。结果与对照组相比，转染有Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３的ＰＣ－２细胞生长速度减慢、增殖率降低，软琼脂集落形成能力丧失。结论以腺病毒为载体恢复野生型ｐ５３在胰腺癌细胞的表达，可抑制癌细胞的生长和部分逆转其恶性表型。     

鼠视网膜的免疫原性

为探讨视网膜的免疫原性,选择ＤＢＡ／２鼠（ＭＨＣ为Ｈ－２＾ｄ）为供体,Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＨＣ为Ｈ－２＾ｂ）或ＢＡＬＢ／Ｃ鼠（ＭＨＣ为Ｈ－２＾ｄ）为受体,把ＤＢＡ／２鼠的半个视网膜移植于受体鼠的皮下,２周后检测迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）。结果示移植组的迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞介导的细胞毒效应（ＣＴＬ）均低于阳性对照ＤＢＡ／２鼠脾细胞组,高于阴性对照假手术组。提示ＤＢ     

p53基因失活与大肠腺癌病理改变的关系

目的探讨ｐ５３基因失活与大肠腺癌Ｄｕｋｅｓ分期、转移等病理改变的关系。方法Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ和ＲＦＬＰ分析大肠腺癌组织中１７ｐＬＯＨ的改变：ＲＴ－ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测大肠腺癌ｐ５３基因ｃＤＮＡ突变;两种单抗（ＰＡｂ２４０．ＰＡｂ１８０１）ＬＳＡＢ免疫组化方法检测大肠腺癌ｐ５３蛋白表达,ＳＰＳＳ下Ｆｉｓｈｅｒ'ｓｅｘａｃｔｔｅｓｔ处理结果。结果１０９例大肠腺癌中,１７ｐＬＯＨ与Ｄｕｋｅｓ＇Ｄ期和远处转移有关（Ｐ＜０．０１）;１８７例大肠腺癌中,ｐ５３基因ｃＤＮＡ突变与Ｄｕｋｅｓ'Ｃ期和淋巴结转移有关（Ｐ＜０．０１）;１００例大肠腺癌中,ＰＡｂ２４０和ＰＡｂ１８０１单抗阳性率分别为７６％和６２％,两种单抗相加总阳性率为８２％。ｐ５３蛋白高表达与Ｄｕｋｅｓ＇分期及癌转移间的关系无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论ｐ５３基因失活参与大肠腺癌的病理发展各阶段和转移行为;高频率的ｐ５３基因ｃＤＮＡ突变和高频率１７ｐＬＯＨ的出现,分别提示Ｄｕｋｅｓ'Ｃ期和Ｄｕｋｅｓ'Ｄ期的病理阶段形成,这两种ｐ５３基因的改变分别提示淋巴结转移和远处转移的分子生物学标记。免疫组化方法可检测突变型ｐ５３基因产物高表达,对大肠肿瘤良恶性细胞鉴别     

大肠良恶性病变p53,PCNA的表达与S100^＋DC浸润的临床病 …

目的：探讨ｐ５３,ＰＣＮＡ的表达和Ｓ－１００阳性树状细胞（Ｓ１００＾＋ＤＣ）浸润在大肠肿瘤发生发展中的作用及意义。方法：应用免疫组化ＬＳＡＢ法检测６４例大肠腺癌,３６例大肠腺瘤、３２例大肠炎性组织ｐ５３、ＰＣＮＡ表达及Ｓ１００＾＋ＤＣ浸润。结果：ｐ５３在大肠腺瘤、大肠腺瘤、大肠炎性组织和阳性表达率分别为６４．１％（４１／６４）,８．３％（３／３６）和０（０／３２）,癌与非癌组织间有显著性差异（Ｐ〈     

腺病毒介导多基因对胆管癌细胞凋亡的诱 导和肝细胞毒性损害

目的：研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２）对胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９ 凋亡的诱导作用和对正常肝细胞的作用。方法：应用ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检测法和光镜观察,分析同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２ ４ 种目的基因的重组腺病毒载体（Ａｄ－ｍ ｕｌｔｉｇｅｎｅｓ）对胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９ 和肝细胞系Ｌ０２的作用以及对大鼠肝脏的毒性损害。结果：Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ与化疗药物顺铂协同,能诱导３０％ 左右的ＱＢＣ９３９发生凋亡,并对肝细胞系Ｌ０２ 和大鼠肝细胞无明显毒性损害。结论：Ａｄ－ｍ ｕｌｔｉｇｅｎｅｓ能诱导胆管癌细胞ＱＢＣ９３９ 发生凋亡,且与化疗药物顺铂具有协同增强作用。初步分析对人肝细胞及大鼠肝脏无明显毒性损害,具有一定的临床应用前景。     

Effect of Ad-p16 Combined with CDDP or As_2O_3 on Human Bladder Cancer Cells

Summary:To evaluate the therapeutic efficiency of combined use of p16-expressing adenovirus andchemotherapeutic agents CDDP or As_2O_3 on human bladder cancer cell line EJ,the human bladdercancer cell line EJ were transfected with adenovirus-mediated p16 gene(Ad-p16),with administra-tion of cisplatin(CDDP)or arsenic trioxide(As_2O_3).The cell growth,morphological changes,cellcycle,apoptosis and molecular changes were measured using cell counting,reverse microscopy,flowcytometry,cloning formation,immunocytochemical assays and in vivo therapy experiments to evalu-ate the therapeutic efficacy of such combined regimen.Ad-p16 transfer and CDDP or As_2O_3 adminis-tration to EJ cells could exert substantially stronger therapeutic effects than the single agent treat-ment.Especially in in vivo experiments,combined administration of p16 and CDDP or As_1o_3 inducedalmost tumor diminish compared to the partial tumor diminish induced by single agent.Moreover,delivery of Ad-p16,or administration of minimal-dose CDDP     

Effect of Ad-p16 combined with CDDP or As<Subscript>2</Subscript>O<Subscript>3</Subscript> on human bladder cancer cells

Summary To evaluate the therapeutic efficiency of combined use of p16-expressing adenovirus and chemotherapeutic agents CDDP or As₂O₃ on human bladder cancer cell line EJ, the human bladder cancer cell line EJ were transfected with adenovirus-mediated p16 gene (Ad-p16), with administration of cisplatin (CDDP) or arsenic trioxide (As₂O₃). The cell growth, morphological changes, cell cycle, apoptosis and molecular changes were measured using cell counting, reverse microscopy, flow cytometry, cloning formation, immunocytochemical assays andin vivo therapy experiments to evaluate the therapeutic efficacy of such combined regimen. Ad-p16 transfer and CDDP or As₂O₃ administration to EJ cells could exert substantially stronger therapeutic effects than the single agent treatment. Especially inin vivo experiments, combined administration of p16 and CDDP or As₂O₃ induced almost tumor diminish compared to the partial tumor diminish induced by single agent. Moreover, delivery of Ad-p16, or administration of minimal-dose CDDP or As₂O₃ or combined regimen could induce massive apoptosis of EJ cell. Cell cycle analysis demonstrated that administration of CDDP or As₂O₃ remarkably arrested EJ cell in G₁ prior to apoptotic cell death. When treated with combined regimen, cells were arrested in G₁ to a greater extent prior to apoptotic cell death. It is concluded that after introduction into EJ cell, Ad-p16 shows enhanced therapeutic efficacy for EJ cell when used in combination with CDDP or As₂O₃. ZHU Zhaohui, male, born in 1968, Doctor in Charge The project was supported by the grants from Project 863 (No. Z20-01-02).     

p16和p53基因及顺铂联用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：探索p16基因和p53基因及p16基因和顺铂（CDDP）联合应用对体内外胆管癌细胞系生长的抑制作用。方法：将重组体腺病毒p16（Ad-p16）和Ad-p53及Ad-p16和CDDP联合作用于人胆管癌细胞系QBC939，观察和分析其对体内外胆管癌细胞生长抑制作用及其机制，结果：Ad-p16在QBC939细胞中表达能抑制QBC939细胞的生长，与p53、CDDP联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长，p16和p53基因诱导癌细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡，CDDP能诱导癌细胞发生G2期阻滞和细胞凋亡；裸鼠皮下移植瘤模型瘤体内注射Ad-p16及腹腔内注射CDDP均能抑制QBC939肿瘤的生长，两者联合应用具有协同作用。结论：p16基因和p53基因及CDDP联合应用具有协同作用。     

顺铂诱导凋亡耐受胃腺癌细胞坏死性死亡

目的了解顺铂诱导胃腺癌细胞死亡的方式,并进一步探讨Puma、Noxa的表达水平和胃腺癌细胞凋亡敏感性的关系。方法四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞生存率;Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡;PI流式细胞术检测细胞膜的完整性;半定量RT-PCR法检测p53、Puma、Noxa的mRNA水平。结果顺铂诱导胃腺癌细胞死亡具有剂量和时间依赖性,48h时IC50为3mg／L;3mg／L顺铂诱导0、8、16、24、32、40、48h后BGC-823细胞凋亡率分别为3．5％、4．1％、4．9％、5．5％、7％、9．3％、12％;非凋亡性死亡率分别为0％、17．6％、21％、25．4％、29．8％、32．9％、37．7％;PI阳性细胞率分别为6．7％、20．6％、24．9％、29．9％、36．3％,41．2％、48．6％;顺铂诱导前后细胞p53、Noxa的mRNA表达水平变化不显著（P〉0．05）,Puma可能不表达。结论顺铂诱导凋亡耐受胃腺癌细胞发生非凋亡性死亡,推测其可能为细胞坏死;胃腺癌细胞的凋亡耐受可能和顺铂不能诱导细胞p53及其转录靶点Puma和Noxa表达增加相关。     

腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的.     

三氧化二砷联合阿霉素对人淋巴瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）联合阿霉素（adriamycin, ADM）对淋巴瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法：将Raji细胞分为实验组与对照组,实验组分为1 μmol/L As2O3组、2 μmol/L As2O3组、ADM组、1 μmol/L As2O3与ADM联合组、2 μmol/L As2O3与ADM联合组。用As2O3和ADM干预不同时间的人淋巴瘤细胞株Raji,采用Wright-Giemsa染色法观察细胞凋亡的形态学变化;采用噻唑蓝比色法检测As2O3联合ADM对淋巴瘤细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测As2O3联合ADM对淋巴瘤细胞凋亡率及淋巴瘤细胞内ADM荧光强度的影响;半定量聚合酶链反应检测As2O3和ADM对淋巴瘤细胞p53表达的影响。结果：As2O3联合ADM作用细胞24h后,可观察到细胞出现凋亡形态学改变。与As2O3和ADM单药组相比,As2O3联合ADM可增强对Raji细胞的抑制率,差异有统计学意义（P＜0.05）,其作用呈浓度和时间依赖性;As2O3与ADM联合组与单药组相比,Raji细胞的凋亡率差异具有统计学意义（P＜0.05）;As2O3和ADM单药组及联合组p53的表达水平均低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;另外,加入1 μmol/L和2 μmol/L As2O3后细胞内ADM的荧光强度分别为18.53和18.12,分别增加0.056倍和0.023倍,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：As2O3和ADM单药及两种药物联合体外均可抑制淋巴瘤细胞增殖,诱导凋亡和下调突变型p53;As2O3和ADM联合体外有协同抗淋巴瘤作用;As2O3对Raji细胞内ADM浓度无显著影响;As2O3可增强淋巴瘤细胞的化疗敏感性,其下调突变型p53的表达可能是其分子水平的作用机制之一。     

三氧化二砷诱导人脑胶质瘤干祖细胞凋亡及其机制

目的研究三氧化二砷（As2O3）对人脑胶质瘤干祖细胞增殖和周期的影响及其相关分子表达。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定As2O3对人脑胶质瘤干祖细胞抑制率,流式细胞术检测As2O3对该细胞凋亡和周期的影响,透射电镜观察细胞形态学变化,Western blot和RT-PCR检测Fas、FasL和p53变化。结果 As2O3可明显抑制人脑胶质瘤干祖细胞的增殖,且呈一定的时间剂量依赖关系（P〈0.05）;此外,人脑胶质瘤干祖细胞周期G1期细胞的比例增加,S期和G2/M期细胞的比例减少;通过形态学观察发现,随着As2O3剂量的增加,镜下凋亡细胞比例逐渐增加,凋亡小体的数量增加;Western blot检测发现,FasL表达上调,p53下调（P〈0.05）。结论 As2O3对人脑胶质瘤干祖细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与上调FasL和下调p53表达相关。     

Interaction between gene p53 and oncogene mdm2 in human glandular lung cancer cell line GLC-82

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｎｃｏｇｅｎｅｍｄｍ２ａｎｄｗｐ５３ｉｎｈｕｍａｎｇｌａｎｄｕｌａｒｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＧＬＣ８２．ＭｅｔｈｏｄｓＢｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅｍｅｄｉａｔｅｄＤＮＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ,ｗｐ５３ａｎｄｍｄｍ２ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｓｅｐａｒａｔｅｌｙｏｒｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＧＬＣ８２ｃｅｌｌｓｖｉａｒｅｔｒｏｖｉｖａｌｖｅｃｔｏｒｐＤＯＲｎｅｏ,ａｃａｒｒｉｅｒｏ…     

腺病毒介导野生型p53基因对人肺腺癌细胞的抑制效应

目的：p53基因突变是人类肿瘤中常见的遗传学改变。将野生型p53基因导入一些肿瘤细胞中被证明能抑制其细胞增殖，因此做为肺癌基因治疗主要目的基因而备受关注。本研究旨在观察野生型p53基因对人肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制效应，并对其抑癌机制进行分析，为今后肺癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法：采用重组体腺病毒Ad-p53基因转染人肺腺癌细胞系GLC－82；以裸鼠皮下移植瘤治疗试验观察Ad-p53基因的抑瘤效应；用流式细胞计数，DNA片断化及TUNEL分析探讨Ad-p53基因的抑癌机制。结果：导入Ad-p53基因后人肺腺癌GLC－82细胞生长能力显著下降，克隆形成能力受到明显抑制；并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；肺癌细胞发生凋亡，并出现明显的G1期阻滞现象。结论：腺病毒介导野生型p53基因（Ad-p53)对人肺腺癌细胞和裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制效应，主要通过诱导癌细胞凋亡和参与细胞周期调控实现，进而提示Ad-p53基因有可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用。