真核细胞RNA的提取和mRNA纯化方法探讨

为采取简便、快速、经济的方法获得高质量的RNA和mRNA，本实验比较了氯化铯超速高心、胍盐／热酚法和“一步法”提取总RNA以及采用Oligo（dT）玻璃柱或离心柱分离纯化mRNA的方法.结果表明:“一步法”与任一种纯化mRNA的方法合用均能获得高纯度、未被降解的RNA和mRNA而可被用于多种实验研究。     

大鼠心肌总RNA的提取

目的 建立一种高效快速提取大鼠心肌总RNA的方法，为心肌组织mRNA的检测提供条件。方法 利用高浓度强烈变性剂(异硫氰酸胍)使细胞结构迅速破坏，并直接通过酚等有机溶剂处理、离心，使RNA与细胞DNA、蛋白质、细胞残片等分离，迅速得到总RNA。结果 得到高纯度、未被降解的总RNA。结论 此法简洁高效，耗时短，完全可用于临床分析工作。     

粪肠球菌总RNA提取方法的比较研究

目的:建立一种简易有效的粪肠球菌总RNA提取方法。方法:用3种不同的方法提取粪肠球菌RNA,用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪检测提取物的取得率及质量并比较结果。结果:在RNA提取之前加入70%乙醇可有效处理细菌细胞,增加细胞对裂解液的敏感性,再用溶菌酶处理能很好地被消化,获得一种快速、简洁和有效的提取方法。结论:本研究成功的得到一种简易的、改良的粪肠球菌RNA提取方法(方法3)。这是一种适用于粪肠球菌和其它革兰阳性菌的有效提取方法,可用于粪肠球菌和其它革兰阳性菌的分子生物学操作和快速诊断技术。     

四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较

目的比较纯化弓形虫速殖子的四种方法对虫体RNA的影响。方法以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠,72h后收集小鼠腹腔液,以胰蛋白酶消化法、微孔滤膜过滤法、G3滤斗和CF-11纤维素柱法纯化弓形虫速殖子,用AGPC法抽提总RNA,用甲醛变性胶电泳检测总RNA。结果胰蛋白酶消化法虫体回收率最大,但时间长,易造成RNA降解;微孔滤膜过滤法回收率低;G3滤斗纯度不高;CF-11纤维素柱法快速简单、纯度高,对RNA无影响。结论微孔滤膜过滤法、CF-11纤维素柱法对虫体RNA的影响小,较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化。     

用TRIzol试剂抽提新生鼠脑组织总RNA

目的:建立一种快速提取组织RNA的方法.方法:Trizol试剂抽提组织总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳.结果:用此法提取的总RNA通过甲醛变性凝胶电泳获得完整RNA条带.结论:此方法提取的总RNA完整无降解.     

半夏叶片总RNA四种提取方法及效果的比较

目的 针对三叶半夏成熟叶片化学成分复杂,富含多糖、酚类及其他多种化学物质的特点,选择优化一种简便、经济、高效的半夏成熟叶片高质量总RNA提取方法.方法 用4种不同的RNA抽提方法如异硫氰酸胍法、皂土法、CTAB-LiCl法和改进的SDS/酚法提取总RNA,通过电泳、紫外分光光度计检测以及RT-PCR验证等对提取结果进行分析比较.结果 4种方法均能从半夏成熟叶片中提取到总RNA.其中皂土法的提取过程只需3～4h,是其他3种提取方法所用时间的一半.提取1g叶片的成本只有其他3种方法的1/13～1/14.此法提取的总RNA 18S、28S带型清晰无弥散,完整性好,无严重的蛋白质和其他杂质污染,A260/A280为1.8～2.0,A260/A230大于2.0,且总RNA的产率高,为365.744 μg/g鲜重,提取的总RNA适用于RT-PCR试验.结论 皂土法提取的RNA完全适用于DDRT-PCR、Northern blotting、cDNA文库构建等分子生物学研究,是一种快速、经济,适于抽提半夏总RNA的好方法.     

一种简便的RNA完整性检测方法

目的探索一种简便、适用的鉴定RNA完整性的方法。方法在常规琼脂耱凝胶电泳的基础上,为防止RNA降解而加以改进。结果提取的总RNA用此方法电泳后可得到28S、18S、5．8S（5S）三条清晰的rRNA条带,28S与18S的带宽比为2：1。结论该方法能对RNA完整性进行快速鉴定,简便可行,节约省时。     

显微操作仪快速分离癌细胞并提取微量RNA的方法

目的建立一种快速分离、纯化肿瘤组织癌细胞并提取微量RNA的方法。方法将肿瘤组织冰冻切片,快速染色,在镜下用显微操作仪从切片上分离癌巢,收集癌细胞,提取RNA并鉴定。结果冰冻切片染色清楚,癌巢分离准确,成功抽提到高质量的RNA。结论显微操作仪可以代替激光捕获显微切割仪进行特定细胞的分离,该方法可用来从少量组织的特定细胞中抽提RNA。     

鸡整胚原位杂交RNA探针的制备

目的：：建立一种快速、简便、高效的鸡胚整胚原位杂交地高辛标记的RNA探针的制备方法。方法：应用RT-PCR方法从鸡胚总RNA中扩增目的片段,连接到PGM-T克隆载体上,分别利用PGM-T载体中的SP6和T7 RNA 聚合酶上的启动子,以线性化的DNA为模板体外转录成地高辛标记的正反义 RNA探针。结果：成功得到地高辛标记的 RNA 探针,探针在鸡整胚原位杂交中有杂交信号。结论：成功转录得到地高辛标记的正反义探针,为后续的以鸡胚为模型整胚原位杂交试验做好了探针的准备。     

显微操作仪快速分离癌细胞并提取微量RNA的方法

目的：建立一种快速分离、纯化肿瘤组织癌细胞并提取微量RNA的方法。方法：将肿瘤组织冰冻切片，快速染色，在镜下用显微操作仪从切片上分离癌巢，收集癌细胞，提取RNA并鉴定。结果：冰冻切片染色清楚，癌巢分离准确，成功抽提到高质量的RNA。结论：显微操作仪可以代替激光捕获显微切割仪进行特定细胞的分离，该方法可用来从少量组织的特定细胞中抽提RNA。     

快速免疫结合试验检测梅毒螺旋体抗体方法的评价

目的：使用两种快速免疫结合试验检测梅毒螺旋体抗体，可使假阳性降到极低。方法：使用目前国内最常用的快速检测试剂，TP-ELISA试剂筛检临床阳性标本，TPPA法作为确证试验，从而得出快速试剂的假阳性和假阴性率。结果：在初筛检出的阳性标本中，TP-ELISA法无假阳性和假阴性。快速试剂1假阴性率1．69％，假阳性率7．27％，快速试剂2假阴性率1．69％，假阳性率4．65％，但如果两种试剂结合使用在本实验中可使假阳性率降为零。结论：在检测门急诊患者时，可用两种快速试剂结合检测梅毒螺旋体抗体。     

人心肌肌凝蛋白重链的制备研究

目的：探讨制备人心肌肌凝蛋白重链（MHC）的方法,为制备其抗体提供抗原。方法：采用改良性制备人心肌MHC,通过SDS-PAGE及Western印迹分析其纯度及抗原特性。结果：①SDS-PAGE显示,纯化的人心肌MHC呈现只有一分子量较大的代表人心肌MHC带的典型图像;②Western印迹显示,200ku处有一典型的感光带。结论：所用的改良法能有效地提取纯化人心肌MHC,可满足制备其抗体的需要。     

大孔树脂分离纯化山楂总黄酮的研究

目的研究大孔吸附树脂分离纯化山楂总黄酮的工艺条件。方法以紫外可见分光光度法测定的山楂样品溶液中总黄酮的含量为指标,采用正交试验和单因素考察相结合的方法考察多个工艺参数。结果D101型大孔树脂对山楂的总黄酮有良好的吸附,其吸附分离工艺条件的药液浓度为0.1g.ml-1、pH3~4,上样量为4倍柱体积,以1m l.min-1吸附速率进行吸附,4.5倍柱体积的80%乙醇洗脱效果最佳。结论方法简单易行,分离效果良好,适于山楂中总黄酮的分离纯化。     

基于PCR的siRNA表达框的制备

目的 改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用。方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板。选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH—SY5Y细胞48h后提取RNA进行RT—PCR,检测RNA干扰的效应。结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确。细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制。结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究。     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。     

大孔树脂吸附法对黄芩总黄酮富集纯化工艺的研究

目的:研究大孔树脂富集精制黄芩总黄酮的方法,确定最佳工艺条件和参数.方法:以黄芩总黄酮为考察指标,筛选出最适型号树脂,采用L9(34)正交试验设计,考察样品液浓度、静态吸附时间、洗脱液乙醇浓度等因素对黄芩总黄酮含量的影响.结果:1300型号树脂为黄芩总黄酮最佳精制纯化树脂,最佳吸附与解吸条件为样品液质量浓度4.0 mg/ml(pH 5.0)、静态吸附时间30 min、30%乙醇洗脱.结论:大孔吸附树脂可以用于精制纯化黄芩提取物,提高总黄酮含量.