一起诺如病毒引起的急性胃肠炎RT-PCR检测

目的对急性胃肠炎疫情标本进行疑似诺如病毒核酸RT-PCR检测,以确诊其致病原。方法从34例病人粪便中提取RNA,用引物JV13i、JV12y进行诺如病毒核酸RT-PCR扩增,再对其扩增产物进行琼脂糖凝胶检测;同时采用ELISA法检测粪便中的诺如病毒抗原,并用基因序列分析进行检测结果验证。结果34份标本中有26份诺如病毒核酸RT-PCR检测阳性,阳性率为76.5%,经基因序列分析,也证实为诺如病毒;而ELISA只检测到9份标本为阳性,阳性率为26.5%。结论RT-PCR和ELISA的阳性结果均证实该起疫情为诺如病毒感染所致。RT-PCR法比ELISA法灵敏度高,特异性强,且成本较低,但是操作较为繁琐。     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测手足口病病毒核酸的应用价值。方法采集2009年5-8月奉贤区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和咽拭子标本,分别用实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71、Coxsackie A16(CoXA16)病毒进行检测。结果在对38例疑似病例的粪便和咽拭子标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到EV71、CoXA16阳性标本为63份,阳性率为82.89%;而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到52份阳性标本,阳性率为68.42%。结论实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的。因此,该方法对肠道病毒的流行病学调查及控制起重要作用。     

1例输入性基孔肯雅病例的实验室检测

目的通过系统的实验室检测发现并确认1例输入性基孔肯雅病例。方法根据基孔肯雅病毒基因序列设计引物和荧光标记探针,利用实时荧光RT-PCR和常规RT-PCR检测方法对广东出入境检验检疫局发现的1例入境发热患者的血清样本进行检测,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列测定。结果通过实时荧光RT-PCR和常规RT-PCR 2种实验方法在该病例标本中检出基孔肯雅病毒核酸;对RT-PCR扩增产物进行序列测定,测出的521个碱基与GeneBank数据库公布的基孔肯雅病毒核酸序列进行比对,结果显示同源性高达99%。结论结合该患者临床症状、实验室检测结果及流行病学调查结果,判断该病例为输入性基孔肯雅病例。     

应用荧光定量PCR技术检测肠道病毒71型

[目的]探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒EV71病毒核酸的应用。[方法]采集2008年5月深圳市龙岗区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和疱疹液标本,分别用实时荧光RT-PCR方法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71病毒进行检测。[结果]在对16例已收集到的患者的粪便、疱疹液标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到8份阳性样本,阳性率为50.O%(8/16),而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到5份阳性样本,阳性率为31.3%(5/16)。[结论]实时荧光RT-PCR技术具有特异性强,灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的,因此该方法对肠道病毒的流行病学调查及治疗起重要作用。     

出入境人员丙型肝炎病毒核心蛋白基因巢式RT-PCR检测及分型研究

目的建立一种检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因的巢式RT-PCR方法,以及HCV核心蛋白基因区测序分型方法。方法从国际HCV数据库查找HCV核心蛋白基因序列,设计HCV RNA巢式RT-PCR引物及测序引物,并建立巢式RT-PCR反应体系。采用出入境人员抗-HCV阳性血清60份,及50份标本为HCV抗体检测阴性,且谷丙转氨酶(ALT)>100U/L的血清进行巢式RT-PCR检测,阳性结果使用本研究建立的测序引物进行基因测序以确定HCV基因型。结果 60份抗-HCV阳性血清中,42份(70.0%)核心蛋白基因RT-PCR扩增阳性,其中1b型27例、1a型12例、6a型1例、3a型1例、2a型1例。50份ALT>100U/LR抗-HCV阴性标本中,1份HCV核心蛋白基因RT-PCR扩增阳性,测序鉴定为3a型。结论本研究建立了一种HCV RNA核心蛋白基因的巢式RT-PCR检测和分型方法,为出入境人员HCV的诊断和监测提供重要依据。     

实时荧光定量RT-PCR技术在手足口病疫情监测中的应用

[目的]对手足口病患者标本进行病毒核酸检测,探讨实时荧光定量RT-PCR方法在手足口病疫情监测中的意义。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR方法对2010年3～8月连云港市采集的307份手足口病患者标本进行肠道病毒核酸检测,并对肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行分型。[结果]307份手足口病患者标本中有221份肠道病毒核酸阳性,阳性率71.99%,其中EV71型病毒核酸阳性标本123份,阳性率40.07%,CVA16型病毒核酸阳性标本66份,阳性率21.50%。[结论]实时荧光定量RT-PCR方法耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为手足口病疫情监测的诊断方法。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

肠道病毒CODEHOP巢式RT-PCR检测及基因分型方法的建立

目的建立一种可用于肠道病毒的快速检测和基因分型的一致简并引物巢式RT-PCR方法。方法根据genbank发表的不同肠道属病毒多聚蛋白氨基酸序列,用CODEHOP在线软件设计1对肠病毒属简并引物,并在该引物的扩增区域内用Primer 3.0软件设计了EV71、COXA16和COXA10 3个病毒的特异引物,建立了巢式RT-PCR方法,对其检测灵敏度、特异性进行了分析,并对27份手足口病患者粪便样品进行了检测。结果该方法第1轮简并引物扩增的灵敏度是17 ng;第2步分型引物扩增的灵敏度是第1步反应的100倍。27份手足口病患者粪便样品RT-PCR检测结果为阳性,其中15份样品经检测为EV71病毒阳性,10份样品经COXA16病毒阳性,2份样品经检测为COXA10病毒阳性。结论建立的一致简并引物巢式RT-PCR检测方法具有特异强、灵敏高的优势,可用于肠道病毒的检测和基因分型。     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测副流感3型病毒

目的:建立特异、快速、灵敏的荧光定量RT-PCR方法用于副流感3型病毒核酸检测。方法:对副流感3型病毒的N基因应用C lustalW软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqM an-MGB探针,并对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,敏感性和稳定性,同时应用于疑似患者临床标本检测。结果:该方法对副流感3型病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、4型,甲型、乙型流感病毒,麻疹病毒,风疹病毒,腮腺炎病毒,呼吸道合胞病毒和腺病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似患者含漱液标本中直接检出,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:本研究建立的TaqM an荧光定量RT-PCR是一种快速检测副流感3型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

SARS恢复期患者血液与排泄物中SARS-CoV RNA的检测

目的应用巢式逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测严重急性呼吸综合征(SAILS)恢复期患者血液与排泄物中的病毒RNA。方法对连续3次收集的23例确诊SARS恢复期(病程≥21天)患者的血、尿、痰、粪便标本进行核酸提取，设计特异性内外引物，使用巢式RT—PcR的方法进行病毒RNA检测。结果通过巢式RT—PCR，共检测到6份阳性标本，其中粪便标本中检测到4份，检出率为5．8％；痰标本中检测到2份，检出率为2．9％。在尿液和血液标本中未检测到病毒．RNA。结论个别SARS恢复期患者排泄物中有SARS病毒RNA存在，因此对恢复期患者的排泄物应慎重处理，对其引起SARS的再次传播的危险性需要进一步评估。     

发热患者SARS冠状病毒抗体分析

目的了解临床发热患者中是否存在严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV）隐性感染或亚临床感染。方法对2003年5月～7月，SARS流行期间湖北地区临床发热患者373例血清进行SARS冠状病毒（SARS-CoV）抗体（IgG、IgM、N蛋白抗体）酶联免疫吸附法（ELISA）检测和分子生物学（RT—PCR）检测。结果373例发热患者中，检出冠状病毒抗体阳性者24例，阳性率6．43％（24／373），其中SARSIgG抗体、IgM抗体、N蛋白抗体阳性率分别为0．54％，1．34％和5．09％，但SARS-CoVRT—PCR检测均为阴性。结论临床发热患者可能存在SARS-CoV隐性或亚临床感染，患者体内产生针对SARS-CoV的保护性抗体，应具有免疫力和抵抗力。     

检测SARS冠状病毒的套式RT-PCR方法的建立与初步应用

[目的]建立套式RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法。[方法]从广东地区SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及本实验室分离的SARS冠状病毒（SAPS—CoV）组织培养上清中提取RNA，利用针对SARS冠状病毒多聚酶基因的特异性引物，进行逆转录及套式PCR扩增。扩增出的阳性片段连接入pGEM—T载体中，测序后比较其与其他已知SARS冠状病毒的同源性。[结果]从SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及SARS冠状病毒组织培养上清中均可扩增出阳性片段，经测序后证实是SARS冠状病毒特有序列。[结论]针对SARS冠状病毒多泵酶基因所建立的套式RT—PCR方法适用于临床标本及组织培养标本中SARS冠状病毒的检测。     

101例严重急性呼吸综合征患者粪便中SARS冠状病毒RNA的检测

目的　研究严重急性呼吸综合征 (SARS)患者粪便中排出SARS冠状病毒 (SARS CoV)RNA的情况。方法　采用荧光定量聚合酶链反应法 (FQ PCR)检测 10 1例病程为 10～ 5 5d的SARS患者、2 7例非SARS患者和 4 0 0名健康体检人群粪便中SARS CoVRNA。结果　 10 1例SARS患者的粪便标本中 5 8例 (5 7 4 % )SARS CoVRNA阳性 ;2 7例非SARS患者和 4 0 0名健康体检人群的粪便标本均为阴性。SARS患者发病后 10～ 19、2 0～ 2 9、30～ 39和 4 0～ 5 5d ,粪便中SARS CoVRNA阳性率分别为 10 0 % (8/ 8)、6 7 7% (2 1/ 31)、4 7 4 % (2 7/ 5 7)和 4 0 0 % (2 / 5 )。粪便中SARS CoVRNA载量对数值分别为 6 0 6± 2 0 5、4 5 1± 1 2 3、3 82± 1 4 4和 3 5 7± 1 2 5。结论　SARS患者急性期粪便中SARS CoVRNA阳性率和载量对数值最高 ,且随病程延长而下降     

新型冠状病毒RNA核酸的检测方法研究及应用

[目的 ]　研究和建立引起严重的急性呼吸道综合征 (SARS)的新型冠状病毒RNA核酸的检测方法。　 [方法 ]　使用一步法巢式逆转录聚合酶链扩增法 (RT -PCR)。　 [结果 ]　采自临床留观、疑似和临床诊断病人的 10 46份咽漱液 /咽拭子样品中 ,3份样品SARS冠状病毒RNA核酸为阳性 ;在 482份血清样品中 ,有 5份为阳性。　 [结论 ]　一步法巢式RT -PCR能检测患者急性期咽漱液 /咽拭子和血清样品中的新型冠状病毒RNA核酸 ,但样本采集的时间和咽漱液 /咽拭子采集的质量直接影响检测结果     

SARS患者某定点收治医院空气样本中SARS-CoV及其RNA的检测

目的 了解SARS某定点收治医院空气中的SARS病毒污染情况及SARS病毒在空气中的分布和传播特性。方法 采用FA-2型空气微生物采样器在病房区及病房阳台连续采样。将采集到的空气样本洗脱后分别采用细胞分离和逆转录-聚合酶链反应分析,并对细胞分离阳性者作进一步的系列分析鉴定。结果 SARS患者某定点收治医院病房区及阳台空气样本中均有部分PCR结果阳性,SARS阳性率病房区为29％,阳台为20％;其中一份样品中分离出活性病原体,并稳定传代;经免疫荧光染色鉴定阳性,RT-PCR扩增产物的测序结果显示该病原体与已知SARS-CoV的同源性在98％以上。结论 SARS急性期后期与恢复期早期的患者仍然从呼吸道排毒,病毒在距传染源周围1m之内的空气中具有感染活性,在此范围之内存在气溶胶传播的潜在威胁。     

医院污水中SARS冠状病毒核酸的检验

目的　了解收治SARS病人的定点医院污水中是否含有病毒和病毒核酸。方法　采用载阳电荷滤材吸附浓集污水中的SARS冠状病毒 ,消毒前浓集污水 2 5L ,消毒后 2 5～ 5 0L ;采用VERO细胞培养及RT -PCR技术检测SARS冠状病毒。结果　建立的阳电荷浓集方法对污水中加标f2 噬菌体回收率平均 12 7% ,而SARS冠状病毒回收率只有 1 0 2 %。消毒前在 30 9医院和小汤山医院污水的6d监测中均检测出SARS冠状病毒核酸 ;消毒后 ,在 30 9医院只有 3d监测出病毒核酸 ,其余样品均未检出病毒核酸 ;两医院所有的污水回收液中均未检出活病毒或具有感染性的病毒。结论收治SARS病人医院污水中含有SARS冠状病毒核酸 ,但没有检出活病毒或具有感染性的病毒 ,因此 ,在当时条件下 ,医院污水 ,尤其是消毒后污水传播SARS冠状病毒可能性较小。     

广州市2003年冬季传染性非典型肺炎流行病学分析

目的分析传染性非典型肺炎(下称SARS)的流行特点,探讨SARS感染发病的特征,为制定SARS防制策略提供依据。方法用现场流行病学与血清流行病学调查方法,分析广州市2003年冬季SARS流行特征。结果广州市2003年12月16日至2004年1月7日共报告SARS病例4例,男性3例,女性1例,年龄20~40岁;患者病情较轻,无ARDS和死亡;3例患者在发病后5~6d就可检测出SARS-CoVIgG、IgM抗体;均属本地社区感染病例,其中3例患者与经营果子狸的T、S餐厅有流行病学联系,但病例间无直接的流行病传播关系。257名接触者无一例发病;T及S餐厅129名员工中血清SARS-CoVIgG阳性率为6.20%(8/129),8例SARS-CoVIgG阳性者中1例为报告病例,1例为近期感染轻型病例,1例为2003年初可疑SARS病例,5例为隐性感染者;两餐厅员工的SARS-CoVIgG阳性率明显高于健康对照人群(0.43%)和服务业从业人员(0.29%);T酒家存栏的6只果子狸咽拭子均检出SARS-CoVRNA。结论广州2003年冬季SARS流行强度低、病例病情轻,未显示出有传染性,存在有隐性感染者和轻型病例,SARS-CoV来源与动物(果子狸)密切相关。     

Virus-specific RNA and antibody from convalescent-phase SARS patients discharged from hospital

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is caused by a novel coronavirus (SARS-CoV). In a longitudinal cross-sectional study, we determined the prevalence of virus in bodily excretions and time of seroconversion in discharged patients with SARS. Conjunctival, throat, stool, and urine specimens were collected weekly from 64 patients and tested for SARS-CoV RNA by real-time polymerase chain reaction; serum samples were collected weekly and tested for SARS-CoV antibody with indirect enzyme immunoassay and immunofluorescence assay. In total, 126 conjunctival, 124 throat swab, 116 stool, and 124 urine specimens were analyzed. Five patients had positive stool samples, collected in weeks 5-9. Two patients seroconverted in weeks 7 and 8; the others were seropositive at the first serum sample collection. In this study, 5 (7.8%) of 64 patients continued to shed viral RNA in stool samples only, for up to week 8 of illness. Most seroconversions occurred by week 6 of illness.