cDNA微阵列与寡核苷酸芯片的制备方法

c DNA微阵列和寡核苷酸芯片是常见的合成后点样的 DNA微阵列 ,点样方法主要是通过物理吸附或共价结合的方式将探针固定于载体上。本文总结了近年来国内外文献报道的 c DNA微阵列制备方法 :在多聚赖氨酸包被的玻璃基片表面制备 c DNA微阵列 ;用琼脂糖包被的玻璃基片制备 c DNA微阵列 ;在氨基或醛基修饰的玻璃基片表面制备 c DNA微阵列 ;寡核苷酸芯片的制备方法 :氨基修饰的玻片与 5 `末端带氨基的寡核苷酸探针通过不同的 linker连接 ;硅烷化寡核苷酸直接点样于玻片上制成寡核苷酸微阵列 ;硫代寡核苷酸通过二硫键与巯基修饰的玻片连接 ;水凝胶芯片固定寡核苷酸 ;丙烯酰胺硅烷化的基片与 5′丙烯酰胺修饰的寡核苷酸连接。并展望了基因芯片的应用前景     

交联型丙烯酸酯聚合物分子层用于固定寡核苷酸分子初探

目的探讨在显微玻片上衍生聚合物分子层用于固定寡核苷酸分子的方法，为基因芯片制备和应用提供技术支持。方法利用交联聚合反应，在显微玻片表面衍生丙烯酸酯共聚物分子层，结合基因芯片技术制备寡核苷酸芯片。利用荧光标记的样品和CMT芯片杂交系统对所制备的芯片进行杂交实验，检测寡核苷酸在芯片表面的固定性能，并进行对照实验。结果杂交后的荧光检测表明寡核苷酸在丙烯酸酯共聚物表面上杂交点阵的荧光信号多，信号强度强，杂交点圆润、时一性好。结论利用化学交联法制备的芯片表面能用于寡核苷酸的固定且处理过程简单，为进一步运用到生物芯片制作打下了良好的基础。     

Dystrophin基因缺失检测微阵列构建及应用中技术优化的研究

目的建立Dystrophin基因缺失检测的DNA微阵列技术，并优化其构建及应用中的关键技术条件。方法提取样品基因组DNA，Klenow法随机引物扩增同时FITC荧光标记，并比较生物素标记法。将FITC荧光标记的核酸点样于不同方法活化处理的玻片上并用不同浓度的盐溶液洗脱，测试对DNA固定效率的影响。以分子克隆法获得的Dystrophin基因18个易缺失外显子cDNA片段为探针、APES和poly-Lys联合处理的玻片为基片，制备简易微阵列。分别与DMD/BMD患者及健康人荧光标记的基因组DNA杂交，检测微阵列的质量和评估结果的可靠性。结果APES和poly-Lys联合处理的玻片对核酸固定效率最高，核酸在洗涤过程中的脱落程度随洗液盐浓度的增加而增大；FITC标记步骤简便，生物素标记相对烦琐，但生物素标记杂交后的荧光强度明显高于FITC标记；微阵列杂交信号信噪比较好，各种对照结果满意，检测结果与PCR一致。结论优化了DNA微阵列构建及应用过程中基片表面活化、探针固定、靶基因DNA扩增标记、杂交条件、杂交信号检测分析等方法，为更好地应用微阵列进行Dystrophin基因诊断奠定基础。     

结核杆菌检测基因芯片的制备研究

目的建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术.方法靶基因的制备、标记,用点样仪点于玻片介质上,并经过点样后处理制成基因芯片,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化,计算DNA固定率,分别设计了不同的玻片,不同的点液,不同的点样后处理方法的固定率的测定.结果对结核杆菌检测基因芯片制备的条件和方法优化实验表明,用醛基修饰玻片作为介质,点样液用DMSO溶液作为点样液,点样后芯片处理,以水合1h再干燥30min为佳.结论本研究建立的结核杆菌检测基因芯片的制备技术有较高的效率和可靠的实用性能.     

通用型病毒检测芯片在三种人类致病病毒属检测中的应用

目的 研究制备对人类有致病作用的38个属的病毒寡核苷酸（oligo）基因芯片对三种人类致病病毒的检测能力。方法 应用生物信息学软件设计70-mer oligo探针，固定于玻片载体制备成基因芯片。以痘苗病毒天坛株、甲肝病毒、乙肝病毒作为检测样本，提取病毒核酸，经随机引物扩增、荧光标记，用于芯片杂交，清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果 芯片上oligo探针能与相应病毒的PCR扩增样品杂交，呈现阳性荧光信号。结论 建立的病毒寡核苷酸基因芯片能够检出和区分三种检测病毒，为进行未知病毒的基因芯片筛查方法的建立奠定了基础。     

DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因多态性

目的　建立DNA芯片检测乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)基因多态性的研究方法并对实验条件进行优化。方法　设计多条寡核苷酸探针 ,在硅烷化芯片的特定位置上 ,用点样仪将探针固定 ,并与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交 ,杂交结果影印至硝酸纤维素膜 ,经BCIP NBT避光显色 ,用放大镜观察杂交信号呈暗紫色圆点 ,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型。结果　通过 1次杂交反应可检测HBV前C C区 (nt 1896 1814 )、BCP区 (nt1762 1764)和P区 (nt 52 8 552 )等多个位点的变异 ,与测序分析结果完全一致 ,具有较好的检测灵敏度和重复性。结论　DNA芯片检测HBV基因常见突变位点多态性 ,操作简便易行 ,技术要求不高 ,具有临床推广应用价值 ,而且可以方便地通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应探针 ,扩大基因芯片的检测应用范围 ,为临床检测提供了新的方法     

高性价比寡核苷酸基因表达谱芯片的制备方法

目的探讨探针长度对寡核苷酸(Oligo)基因芯片杂交信号的影响。方法以大肠杆菌基因表达信息作为实验模型,根据已有大肠杆菌全基因组芯片数据选择覆盖高、中、低杂交信号强度的20个大肠杆菌基因,针对该20个基因分别设计59-mer和70-mer长度Oligo探针,并将2种探针点制在同一张芯片中,同时设阳性对照探针和阴性对照点样液。提取大肠杆菌RNA,经过反转录、扩增、荧光标记后与芯片进行杂交反应,采用激光共聚焦扫描仪扫描芯片,利用数据分析软件提取探针的杂交信号值并进行显著性分析。结果大肠杆菌28SrRNA和18SrRNA条带清晰,无降解带出现,质量合格。芯片杂交结果显示59-mer和70-mer长度探针的杂交效率和杂交信号差异无统计学意义(P=0.9810),阳性对照探针出现阳性杂交信号,阴性对照点样液未检测到杂交信号,符合质控要求。结论59-mer长度探针可用来制备Oligo基因芯片,这不仅降低了基因芯片制作成本,而且将推动基因芯片技术更为普及的应用。     

线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建

目的构建用于线粒体DNA（mtDNA）D-环控制区（D—LOOP区）多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片。方法根据GenBank中人mtDNA D—LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N＇-对羧苄基吲哚三菁（Cy5）标记引物]和55种寡核苷酸探针。将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片。提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D—LOOP区片段。取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较。观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化。结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D—LOOP区片段（466bp）与预期表达片段大小一致。不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合。灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0．1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基“C”的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变。结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D—LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测。     

氧化还原电解脱保护DNA在片合成新方法的探讨

DNA芯片是一种新的高通量DNA分析检测技术。DNA芯片把大量已知序列探针集成在基片上 ,通过与标记的若干靶核苷酸序列杂交 ,可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行检测和分析。DNA芯片的制备方法大致可以分为点样法和在片合成法。本文初步探索了以氧化还原电解脱保护法为特征的电助基因芯片制备方法 ,获得了一些有意义的结果     

Au纳米颗粒HBV DNA基因探针的制备及其在目视化检测HBV DNA中的应用

制备金(gold,Au)纳米颗粒乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxynucleic acid,HBV DNA)基因探针,研究其在目视化检测HBV DNA中的应用。Au纳米颗粒通过金-硫(Au-S)共价键结合烷氢硫醇修饰的寡核苷酸,制备检测探针。用荧光标记法检测Au纳米颗粒表面寡核苷酸的覆盖率和与其互补的寡核苷酸的杂交效率。检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针,用斑点杂交法检测HBV DNA,加入银离子(Ag+)-对苯二酚液染色观察结果。制备的Au纳米颗粒粒径为(12±5)nm,分散良好,在520nm有最大吸收峰,经寡核苷酸修饰后,最大吸收峰改变为524nm。Au纳米颗粒表面寡核苷酸的最大覆盖率为(132±10)条,最大杂交效率为(22±3)%。在尼龙膜上用斑点杂交法可检出低至10fmol的合成靶DNA,可目视化检出乙肝患者血清中HBV DNA的PCR产物。Au纳米颗粒HBV DNA基因探针可用于目视化检测HBV DNA,此方法具有敏感性高、特异性好、简单、价廉的特点,可望在许多领域,尤其是在多基因检测芯片上有潜在的应用价值。     

基因芯片技术的研究进展

基因芯片技术的诞生是基于人类基因组计划的成果,它以一种全面、综合、系统的思维方式来研究生命现象。同时,它还是疾病诊断和治疗的重大方法学突破,也是新药开发筛选的新方法。     

DMD基因突变及突变检测技术研究进展

假性肥大型进行性肌营养不良（DMD／BMD）一类发病率较高的X连锁隐性遗传病。DMD基因庞大,突变机制复杂,随着分子生物学的进展,对DMD基因及其所编码aystrophin蛋白的认识不断深入,探索更简便、准确、经济的基因突变检测技术成为目前对DMD研究的热点,本文着重对DMD基因、突变与表型关系的研究进展,以及突变检测技术的进展做一综述。     

基因枪转导K-RLIS反义基因对胰腺癌细胞（K-PLASP21）蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RASP21蛋白的影响。方法利用基因枪技术，将反义基因转导入宿主细胞，通过免疫细胞化学和Westernblot方法，观察K-RAS突变特异性反义基因转导后ASPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RASP21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后，AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达明显降低；BxPC-3胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后，可用于胰腺癌的治疗。     

降钙素基因的化学合成与克隆

本文报道用化学法全合成降钙素的基因。基因全长113碱基对。采用大肠杆菌偏爱密码子。整个基因分为6个片段合成。用T~4DNA连接酶一次连接成功,序列分析证明合成的基因序列与设计的一致。     

基因枪转导K-RAS反义基因对胰腺癌细胞(K-RAS P21)蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RAS P21蛋白的影响。方法利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过免疫细胞化学和Western blot方法,观察K-RAS突变特异性反义基因转导后AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RAS P21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后,AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达明显降低;BxPC-3胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后,可用于胰腺癌的治疗。     

Phylogeny of Thogoto Virus

Thogoto virus is a tick-borne member of the family Orthomyxoviridae. Previously, based on the similarity in antigenic relationship by cross-neutralization test, all virus strains were concluded to have derived from the same origin. In this study, we obtained partial gene sequences of 4 genes (PB1-like protein, PA-like protein, glycoprotein, and nucleoprotein) of 8 Thogoto virus strains isolated in Africa, Asia, and Europe and studied the genetic variation and phylogeny. Unrooted phylogenetic trees created by both neighbor-joining and maximum likelihood methods based on nucleotide and amino acid sequences for 4 genes were mostly similar and revealed two lineages, Euro-Asian and African. Intra-lineage nucleotide sequence variation was greater in the Euro-Asian lineage than in the African lineage for all 4 genes. Furthermore, for the strains of Euro-Asian lineage, variations for two genes associated with RNA-dependent RNA polymerase activities were greater than those for glycoprotein or nucleoprotein gene, based on both nucleotide and amino acid sequence differences as well as on synonymous and nonsynonymous differences, indicating greater mutation rates for the polymerase activity genes in these strains.     

三例眼皮肤白化病患者TYR和P基因的突变分析

目的 分析眼皮肤白化病(oculocutaneom albinism,OCA)患者酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和P基因的基因突变.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)和变性高效液相色谱(de-naturing high-perfomanee liquia chromatography,DHPLC)技术对3例患者的眼皮肤白化病Ⅰ、Ⅱ型相关基因(TYR和P基因)的外显子进行突变检测,并对DHPLC检出的突变样本进行测序和限制性内切酶分析以验证该突变.针对未见报道的新突变,筛查100名表型正常的无关个体,排除多态的可能.结果 在3例患者中检测出两种P基因突变,未检测到TYR基因突变.其中,患者1的P基因第13外显子发生杂合突变T450M;患者2的P基因发生两个杂合突变,分别是第13外显子T450M和第23外显子G775R;患者3的P基因第23外显子发生杂合突变G775R.P基因第13外显子限制性内切酶分析显示,患者1、2均出现杂合突变T450M导致的Oli I酶切位点部分消失,100名表型正常的无关个体未检出该突变;经检索,T450M为一未见报道的新突变.结论 联合应用PCR、DHPLC、DNA测序和限制性内切酶分析的方法可有效的对白化病进行基因诊断.     

人肺癌相关抗原基因ALT04ag的分子克隆及其转化活性的初步研究

本文旨在克隆人肺癌相关抗原基因ALT04ag cDNA全长序列并对其生物信息学特性及转化活性进行初步探讨。采用5'RACE实验程序克隆靶基因全长cDNA，借助生物信息学分析方法对其序列进行初步分析，以细胞生长曲线、FCM分析及RT-PCR技术分别观察重组。ALT04ag表达质粒转染细胞的生长特性及相关基因的表达。结果表明ALT04ag cDNA序列全长1115bp，含有编码194个氨基酸的开放阅读框架，计算预测其分子量为21KD，等电点为5．51。该序列登录Genbank(AF026816)时未发现同源序列(2001-1-30)。该基因转染的细胞有ALT04ag基因表达，ALT04ag基因表达可上调c-myc基因表达及加速细胞增殖速率，但对bcl-2及p53基因表达无影响，提示ALT04ag基因表达可能是细胞癌变的重要因素之一。本研究为探索人肺癌诊断及治疗的分子靶标提供了新的线索。     

原发性肝细胞癌RIT1基因的突变和扩增

目的　探讨 RIT1基因突变和扩增在肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)的发生情况及其与发病的关系。　方法　采用 PCR直接测序法检测 5 0例原发性 HCC患者的肝癌组织和非癌肝组织RIT1基因在所包含的 6个外显子的全序列寻找突变位点 ;并用荧光定量 PCR法检测 RIT1基因的扩增情况。　结果　在 5 0例肝癌组织中 1例出现第 5外显子编码区 2 4 1位核苷酸 G/ C变异 ,其对应密码子改变为GAG81CAG,编码氨基酸改变为 Glu81Gln,该氨基酸变异位于 GTP结合的保守功能域内 ,该病例的非癌肝组织以及其余 4 9例的肝癌组织和非癌肝组织均未发生此种改变 ;在 5 0例肝癌组织和非癌肝组织中均出现 5′- UTR(起始密码子前 2 1位核苷酸 ) G/ C变异 ;在获得有效扩增数据的 4 3例肝细胞癌患者中 ,11例有 2～2 97倍的 RIT1基因扩增 ,扩增率为 2 5 .6 %。　结论　基因扩增是 RIT1基因在肝细胞癌的激活方式之一 ,可能与肝细胞癌的发病有关 ,而点突变方式可能意义不大。     

不同选择剪接形式的小鼠Era在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:对不同剪接形式的小鼠era基因(mera)进行克隆、原核表达,并进行纯化,检测抗人Era蛋白抗体对于两种剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后鼠Era蛋白的研究奠定基础。方法:采用两种剪接形式era基因的MBP融合表达载体(pMAL-meraW,pMAL-meraS),在大肠杆菌中进行表达,对其进行纯化,并应用Westernblot鉴定了抗人Era蛋白抗体的特异性。结果:原核表达的MBP-mEraW、MBP-mEraS融合蛋白经过薄层扫描后发现其分别占菌体总蛋白的17%、19%;纯化后的融合蛋白纯度为67%和61%;用抗人Era蛋白抗体进行Westernblot发现抗体特异性较好,适合两种剪接形式的鼠Era蛋白的检测。结论:利用原核系统高效表达了不同剪切形式的鼠era基因,并检测了兔抗人Era蛋白抗体对不同剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后对鼠era基因的研究奠定了基础。