表达重组人生长激素的大肠杆菌高密度发酵的初步试验研究

根据表达重组人生长激素的大肠杆菌的自身特点，对其发酵的工艺和条件作了初步的研究和改进，通过以甘油代替葡萄糖作为培养基中的碳源，以流加的方式在发酵过程中逐步补加；同时，通过控制搅拌转速，以控制溶氧不低于２０％的水平，在发酵的中后期，再以流加的方式补充适量的蛋白胨等营养成份，使发酵终止时，大肠杆菌的密度由３０ｇ／Ｌ提高至９０ｇ／Ｌ，而ｒ－ｈＧＨ的细胞表达量并未因此而受到影响，发酵周期从１６ｈ缩短到１０     

甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响

考察了5L发酵罐中三种甲醇流加策略(恒溶氧、恒比生长速率和恒甲醇浓度)对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子(hALR)的影响。控制恒定甲醇浓度为10g/L诱导时,甲醇比消耗速率和hALR表达速率显著高于其它两种流加策略,最终hALR表达水平为360mg/L。     

用氮源调控的FLD1启动子开发在毕赤酵母中生产外源蛋白的高细胞密度流加补料培养技术

构建了一株可在P．pastoris甲醛脱氢酶1基因的启动子（PFLD）转录控制下，表达稻根霉脂肪酶基因的毕赤酵母重组菌，以研究该表达系统可否用于无需甲醇诱导的高细胞密度流加补料培养技术生产重组蛋白。使用PFLD系统开发了简单可靠的流加补料技术，在诱导期分别用甲胺和山梨醇作为氮源和碳源。在3种恒定生长速率下分别进行3项流加补料发酵试验，     

溶氧浓度对rhG-CSF工程菌高密度发酵的影响

目的确定rhG-CSF工程菌高密度发酵的最佳溶氧浓度。方法通过通入纯氧,高密度发酵的溶氧值可以精确控制。考察不同溶氧浓度对工程菌的生长、质粒丢失率、乙酸积累情况以及rhG-CSF表达的影响,来确定溶氧的最佳控制范围。结果工程菌生长阶段溶氧控制在25%,诱导后控制在35%,最有利于菌体生长和外源蛋白表达,最终菌体密度为(79.6±2.1)g/L,表达量为(40.2±1.2)%。结论溶氧对工程菌rhG-CSF高密度发酵有显著影响。     

用于确定动物的线虫感染抗性的有效重组抗原Aspin在大肠杆菌中的表达

报道了重组蛋白Aspin——由寄生性Trichostronglus colubriformis产生的一种门冬氨酰蛋白酶抑制剂类似物在大肠杆菌中的表达。研究了表达具生物活性、可溶而非形成包涵体的Aspin并使产量最大化的培养条件。高生长速率和表达水平易形成包涵体。在分批发酵中降低生物反应器的温度、溶氧水平和营养物浓度，使表达处于低水平，均能有效增加可溶性Aspin的表达量。分批发酵中，以2g／L的L-阿拉伯糖诱导，培养温度从37℃降至25℃获得了Aspin220mg／L的高表达量。因为最终的酸性pH、低溶氧有利于产生可溶性的Aspin发酵过程，故可不控制pH和溶氧。     

溶氧对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响

目的考察发酵液中不同的溶氧浓度对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响。方法通过改变通气量、搅拌转速和辅助通入纯氧的方式将发酵液中溶氧浓度控制到试验设定值。结果当控制发酵液中溶氧浓度在30%时,SAMe产量最高。结论通过控制发酵液中溶氧浓度有助于提高重组毕赤酵母高密度发酵高表达腺苷蛋氨酸。     

由大肠杆菌表达生产重组人干扰素-γ

以常数和可变比生长速率进行分批补料发酵工艺，用于对表达人干扰素-γ(hIFN-γ)的大肠杆菌BL21(DE3)进行高细胞密度培养。通过控制气流和搅拌速度，并在必要时充以纯氧，使溶氧水平保持在空气饱和度的20％～30％。葡萄糖是唯一的碳源和能源。分别以常数和可变比生长速率补料策略进行分批发酵，在36和20h之后获得的终细胞密度分别达到了～100g干细胞重／L。     

固定化大肠杆菌和悬浮大肠杆菌的代谢和氧供给的关系

已经证明,完整细胞的固定化在发酵系统中能提高产物合成量,促进产品的回收.例如Galazzo和Bailey报道固定化啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在包埋床反应器中生长时,乙醇产量比悬浮细胞高45%,葡萄糖吸收是悬浮细胞的2倍,但固定化细胞的比生长率低.Zhang等报道在包埋床反应器中,大肠肝菌在藻酸钙包被的玻璃珠内生长时,经诱导后,每个细胞合成的β-半乳糖苷酶是悬浮细胞的1.6倍(需氧生长时)和4.9倍(微氧生长时).以甘油为碳源时,固定化细胞的细胞产量是悬浮细胞的一半,甘油消耗加倍,乙酸、丙酮酸和乳酸的产量增加.     

重组大肠杆菌高密度培养的进展

重组大肠杆菌高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效方法。选择最佳的表达系统以及培养基和培养方式是获得高密度和高表达的重组大肠杆菌的有效途径。在培养过程中，通过控制副产物、ｐＨ、温度和诱导时机以及补料方式等参数则能有效地限定比生长速率，从而有利于获得最高的密度和最好的表达。文章从这几方面对近期的研究成果和未来的发展趋势进行了综述。     

重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵

目的优化重组人白细胞介素-18的发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达.方法在10L发酵罐中,研究重组人白细胞介素-18工程菌在不同的pH值、溶氧和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响.结果根据优化条件,连续三批重复发酵10L工程菌,最终菌体密度均达A600nm=28,菌体获得量均可达湿重50g?L-1以上.目的蛋白表达量均为40%以上.结论优化了重组人白细胞介素-18基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础.     

必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究

曾利用同源重组技术构建了稳定的必特螺旋霉索基因工程菌。本研究在30L全自动发酵罐从菌体生长，糖、氮源利用及发酵效价增长情况考察了必特螺旋霉索基因工程菌的发酵过程，研究了发酵过程摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、溶解氧(DO)等在线参数的变化，着重研究了不同溶氧水平对必特螺旋霉索发酵的影响。结果表明溶氧水平尤其是发酵前期溶氧水平对必特螺旋霉索发酵影响至关重要，前期临界氧浓度应控制在25％左右。本研究为必特螺旋霉索发酵放大工艺研究提供了依据。     

重组Pichia pastoris的发酵条件初步研究

在摇瓶中进行重组Pichia pastoris菌株SIBAS 5071发酵条件的研究,考察了碳源、底物、pH、磷酸盐浓度、溶氧量等对该菌细胞生长和产生S-腺苷甲硫氨酸(sAM)的影响,初步确定的优化条件下发酵3 d后,SAM产量可达2.3 g/L(118 mg/g干细胞).     

重组胰岛素样生长因子-Ⅰ基因工程菌的发酵研究

目的探讨胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )基因工程菌的摇瓶及发酵罐培养的一些发酵参数、诱导阶段的补料基质及诱导剂浓度对IGF Ⅰ表达的影响。方法通过摇瓶培养和分批及补料分批发酵培养进行研究。结果在摇床转速为 15 0、2 0 0、2 5 0r min条件下测得以葡萄糖为基准的Y△x △s分别为 0 .2 0 3、0 .2 7、0 .33。干细胞产量分别为 0 .5 4、0 .76 5、1.0 5 4g L。平均生长速率分别为 0 .0 34、0 .0 4 8、0 .0 6 6g (L·h)。细胞对数生长期分别为 6、7.5、10h。发酵罐上生物量由分批发酵的 18(A6 0 0nm)提高到补料分批发酵的 35 (A6 0 0nm) ,表达量占细胞可溶性总蛋白质的10 %。结论后期供纯氧与补料能延长对数生长期 ,提高乳糖浓度和诱导前用甘油作碳源有利于IGF Ⅰ表达     

重组人白细胞介素15工程菌高密度发酵条件探讨

目的研究表达重组人白细胞介素15(rhIL-15)工程菌高密度发酵的条件。方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白质表达的因素进行优化。结果以甘油为碳源可明显抑制有害物质乙酸的积累,提高工程菌的表达量和收获率。高密度发酵明显提高了目的蛋白质的表达量和工程菌的产量。结论该发酵工艺大大提高了rhIL-15工程菌的产量和表达水平,为rhIL-15的规模化生产打下了基础。     

新型重组人肿瘤坏死因子工程菌的发酵工艺研究

目的研究并建立新型重组人肿瘤坏死因子 (nrhTNF)的发酵工艺。方法通过探讨nrhTNF工程菌在试管和锥形摇瓶中的生长和表达规律 ,筛选并确定其最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件 ,然后在 5L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果nrhTNF工程菌在 5L发酵罐中培养至终密度A60 0nm30左右时 ,目的蛋白的表达最高 ,保持在菌体总蛋白的 5 0 %附近 ,发酵时间为 12～ 13h。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为nrhTNF的工业化生产奠定了基础。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。     

High Cell Density Cultivation Process for the Expression of Botulinum Neurotoxin a Receptor Binding Domain

The receptor-binding domain of botulinum neurotoxin (H_C fragment), is a promising botulism vaccine candidate. In the current study, fermentation strategies were evaluated to upscale H_C fragment expression. A simple translation of the growth conditions from shake flasks to a batch fermentation process resulted in limited culture growth and protein expression (OD of 11 and volumetric protein yields of 123 mg/L). Conducting fed-batch fermentation with rich media and continuous nutrient supplementation significantly improved culture growth (OD of 40.3) and protein expression (1093 mg/L). A further increase in H_C fragment yield was achieved by high cell density cultivation (HCDC). The bacterium was grown in a defined medium and with a combined bolus/continuous feed of nutrients to maintain desired oxygen levels and prevent acetate accumulation. The final OD of the process was 260, and the volumetric yield of the H_C fragment was 2065 mg/L, which reflects improvement by an order of magnitude. Purified H_C fragments, produced by HCDC, exhibited typical biochemical and protective characteristics in mice. Taken together, the advancements achieved in this study promote large-scale production of the H_C fragment in E. coli for use in anti-botulism vaccines.     

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。