pcDNA3.1/DLC-1 重组质粒的构建及其在HT-29细胞中的表达

 目的 构建和表达DLC-1(deleted in liver cancer)基因重组质粒。 方法 用PCR法得到DLC-1基因片段,此基因片段带有Xba Ⅰ和BamH Ⅰ两个酶切位点,然后将此片段 和真核表达载体pcDNA3.1连接,转化大肠杆菌DH5a,利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质 粒转染到结肠癌HT-29细胞中,再用RT-PCR法检测重组质粒的表达。 结果 重组质粒经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切和测序与DLC-1基因序列一致;利用脂质体介导将 pcDNA3.1/DLC-1重组质粒导入HT-29细胞,获得了DLC-1基因的表达。 结论 成功构建pcDNA3.1/DLC-1重组质粒并在HT-29细胞内表达。     

重组pcDNA3-UpIb promoter-Smac质粒转染靶向膀胱癌的促凋亡效应

目的：探讨转染新构建的UpIb启动子调控携Smac基因的真核表达质粒pcDNA3-UpIb promoter—Smac对膀胱癌细胞的促凋亡效用一方法：用脂质体将质粒转染到膀胱癌BIU-87细胞系中，2dh后用RT—PCR检测Smac的表达，以低剂量丝裂霉素C诱导凋亡，利用倒置光学显微镜、Wrighs—Gimesa染色、DNA凝胶电泳技术、TUNEL-荧光标记技术、流式细胞术检测凋亡。结果：丝裂霉素C处理的各组在倒置光学显微镜和Wrighs—Gimesa染色油镜下可见到典型的凋亡形态学改变，DNA凝胶电泳呈特征性的梯形条带jTUNEL-荧光标记技术及流式细胞术检测转染pcDNA3-UpIb promoter—Smac组凋亡率显著高于单用丝裂霉素C组。结论：转染pcDNA3-Up Ibpromoter—Smac能够通过提高Smac的表达而有效促进丝裂霉素C诱导的膀胱癌细胞凋亡，提示该质粒配合凋亡诱导药物可能成为膀胱癌新的靶向基因治疗手段．     

转染野生型p53对乳腺癌细胞所致细胞凋亡的研究

为研究ｐ５３对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,用重组人野生型ｐ５３全长ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染Ｂｃａｐ３７细胞,观察其增殖的凋亡变化。方法 应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测Ｂｃａｐ３７细胞表达变化,流式细胞仪计数检测细胞增殖及周期变化,ＭＴＴ及苔盼兰计数观察紫外线刺激后细胞存活率差异,ＤＮＡ末端原位标记技术检测细胞凋亡变化。     

Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用

目的 探讨Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用。方法 利用脂质体将真核表达载体pIRES2-EGFP-Noxa瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞,通过RT-PCR检测转染后Noxa基因mRNA的表达,Western blot检测转染后蛋白的表达,MTT 比色法测定细胞增殖的抑制,流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡情况。结果 Noxa基因转染后在乳腺癌MCF-7细胞中成功表达。转染后mRNA及蛋白表达持续上升,其转染后24h、48h、72h mRNA的相对灰度值分别为(0.347±0.031)、(0.703±0.041)、(1.044±0.033),差异具有统计学意义（P<0.05）。转染24h、48h、72h后蛋白表达的相对灰度值为(1.171±0.086)、(1.013±0.088)、(0.886±0.063),差异具有统计学意义（P<0.05）。Noxa基因的表达使得乳腺癌MCF-7细胞出现增殖抑制,其24h、48h、72h抑制率分别为（23.9±4.2）%、（36.6±3.0）%、（47.0±3.3）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测显示MCF 7细胞DNA合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G0/G1 期。其转染24h、48h、72h的G0/G1期分别为（68.1±2.5）%、（72.6±1.5）%、（75.6±0.9）%,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）;其24h、48h、72h凋亡率分别为（11.5±0.9）%、（19.6±0.8）%、（25.4±0.7）%,组间差异有统计学意义（P<0.05）。Hoechst 33342染色显示Noxa基因转染后细胞出现凋亡,其24h、48h、72h凋亡率分别为（7.3±4.1）%、（16.8±3.3）%、（23.8±2.3）%,与阴性对照组相比,其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞后能够抑制细胞增殖并促进其凋亡。     

肿瘤相关基因SNC90 cDNA真核细胞表达型重组质粒的构建及其转染研究 *

目的:构建肿瘤相关基因SNC90哺乳动物细胞表达型载体并进行转染研究.方法:肿瘤相关基因SNC90cDNA片断亚克隆至哺乳动物细胞表达型质粒pREP9中,并运用脂质体和电穿孔法将重组质粒pREP9-SN90转入3株人大肠癌细胞中,用G418筛选抗性细胞克隆.结果:重组体pREP9-SN90对SW1116,COLO205和SW620肠癌细胞株克隆形成均有一定的抑制作用,抑制率分别为72.2%,74.2%和59.7%.结论:这提示肿瘤相关基因SNC90对肠癌细胞生长起负性调节作用.     

血管内皮生长因子受体-3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究

目的研究血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法用基因重组方法构建人反义VEGFR-3基因真核表达载体,用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用WesternBlot分析转染前后细胞中VEGFR-3蛋白的变化。利用Hoechst33258染色和流式细胞仪观察转染后Hela细胞的凋亡情况。结果转染反义VEGFR-3质粒后,Hela细胞VEGFR-3的蛋白表达水平明显下降,细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论抑制VEGFR-3的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡,VEGFR-3可能是肿瘤基因治疗的一个潜在新靶点。     

HSU17714基因反义重组质粒的构建及其对人大肠癌细胞生长的影响

我所应用减式杂交方法筛选人大肠癌负相关基因,得到一与已知基因同源性仅50％的cDNA片段,已作为新发现的基因被NCBI收录入国际基因库,我们将此cDNA片段反向克隆至非整合型哺乳动物表达载体pREP9的多克隆位点中,构建了HSU17714基因的反义RNA表达载体,并籍脂质体将之导入人结肠癌SW1116细胞中,双层软琼脂集落培养试验、流式细胞技术分析及MTT比色法等结果分别提示转染该重组体的肠癌细胞的非锚着依赖性生长能力、增殖周期活性和细胞生长速度均受到不同程度的抑制,说明外源重组体pREP9 HSU17714(AS)对肠癌SW1116细胞的生长具有抑制作用。     

APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT-116中的表达

 目的　构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5,转染人类结直肠癌细胞HCT-116,观察重组质粒在细胞内的表达。方法　根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,设计特异性引物扩增APC基因特异性的功能区域片段。将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP-N3载体的N端,经测序分析对重组质粒pEGFP-N3-APC1～5进行鉴定。使用脂质体转染法将重组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT-116,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达。以RT-PCR法进一步验证重组质粒在细胞中的表达。结果　构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体,重组真核表达载体转染HCT-116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,5个重组质粒在HCT-116细胞中均可表达。结论　真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能,筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础。础。     

IL-23基因转染小鼠乳腺癌细胞的体内外促凋亡作用研究

目的:将小鼠IL-23基因转染小鼠乳腺癌细胞MA-891,检测该细胞在体内外的凋亡变化,探讨IL-23抗肿瘤作用机制.方法:应用逆转录病毒载体(LXSN)将含 IL-23 基因质粒经ψ2(亲嗜性)和PA317(双嗜性) 2种细胞包装,G418筛选获得携带 IL-23 基因的病毒,后者转染MA-891细胞,经G418筛选后获得IL-23/MA-891阳性克隆.用ELISA法检测IL 23/MA-891细胞分泌IL-23的能力,用MTT比色法检测细胞体外增殖能力.小鼠皮下接种转染IL-23/MA-891细胞,观察其体内致瘤性变化;用流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况;用RT-PCR和Western 印迹法检测肿瘤组织Fas和survivin的表达.结果: IL-23 基因成功转染MA-891细胞,获得了IL-23高表达细胞IL-23/MA-891.转染 IL-23 基因不影响MA-891细胞的体外生长和细胞凋亡,但体内 IL-23 基因转染组肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤组织细胞凋亡率增高( P <0.01),细胞表面Fas的表达水平明显增加( P <0.01),survivin表达水平明显降低( P <0.01).结论:转染小鼠 IL-23 基因后对小鼠乳腺癌细胞MA-891的体外凋亡无影响,但在体内 IL-23 可能通过降低survivin表达和上调Fas表达,诱导细胞凋亡而产生抗肿瘤作用.     

维生素E琥珀酸酯联合阿霉素对乳腺癌细胞株Bcap-37的生长抑制作用

目的检测维生素E琥珀酸酯（VES）联合阿霉素（ADM）对乳腺癌细胞生长抑制作用。方法以VES联合ADM作用于人乳腺癌Bcap-37细胞24h和36h，VES浓度为5、10、20mg／L，ADM的浓度分别为0．25、1、2mg／L。采用MTT法测定对细胞增殖的抑制作用，以流式细胞仪分析药物联合作用前后乳腺癌细胞凋亡率的变化和对细胞表面Fas表达的影响。结果VES联合ADM对乳腺癌Bcap-37细胞具有显著的生长抑制和凋亡诱导作用。流式细胞仪分析细胞周期，Bcap-37细胞的自然凋亡率为0．7％，5mg／L和20mg／LVES作用24h后凋亡率分别为10．1％和19．2％，lmg／L和2mg／LADM作用24h后的凋亡率分别为16．0％和23．3％。5mg／LVES联合1mg／LADM以及20mg／LVES联合2mg／LADM作用24h后的凋亡率分别升高至31．1％和40．7％。VES联合ADM作用24h后Bcap-37细胞表面Fas表达增强。结论VES联合ADM对乳腺癌Bcap-37细胞具有显著的生长抑制作用，其机制可能与细胞表面Fas表达上调有关。     

3-甲基腺苷对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响

研究自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-methyladenine,3-MA）对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响。方法：常规培养人乳腺癌T47D细胞,分为对照组、3-MA组、芹菜素组、3-MA+芹菜素组。MTT法检测各组的细胞增殖抑制率;GFP-LC3质粒转染观察各组细胞自噬情况;Hochest/Mito-Red/YO-PRO-1染色法观察各组细胞凋亡形态;AnnexinV/PI双染法流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;Western blot法检测LC3及PARP的变化。结果：MTT示3-MA+芹菜素组的增殖抑制率明显高于其他各组（P<0.05）;GFP-LC3质粒转染结果显示：对照组,3-MA组及3-MA+芹菜素组自噬不明显,而芹菜素组与其他各组相比自噬明显增多（P<0.05）;3-MA+芹菜素组的凋亡细胞增多,各组凋亡率分别为（12.73±0.05）%,（18.46±0.03）%,（23.27±0.07）%,（34.14±0.05）%,与对照组相比有统计学意义（P<0.05）;Western blot结果显示,芹菜素组LC3-Ⅱ增高,而3-MA组及3-MA+芹菜素组的LC3-Ⅱ显著减少,3-MA+芹菜素组PARP的剪切带相比其他各组明显增加。结论：自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后,能够明显增强芹菜素对乳腺癌T47D细胞系的凋亡诱导效应。     

热疗对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的:观察不同加温温度对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响.方法:人宫颈癌Hela细胞株常规方法培养,采用水浴加热法(温度为41℃、42.5℃、43.5℃、)对细胞进行加温处理,处理后继续培养24h.用流式细胞仪检测细胞凋亡,单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)法检测DNA受损状态.结果:随着温度的增加细胞凋亡率增加,42.5℃、43.5℃加温1h后细胞凋亡率最高分别为30.7%和34.6,坏死细胞分别为13.2%和29.6%.单细胞凝胶电泳发现42.5℃加温1h后40.0%的细胞有DNA损伤,43.5℃加温1h后80.0%以上的细胞DNA损伤,而41℃加温处理1h后仅有20.0%细胞DNA受损.结论:单独加温处理1h可诱导细胞凋亡,并导致细胞DNA损伤.     

Bcap—37人乳腺癌细胞系对血卟啉衍生物（HPD）的吸收,分布与排泄

本文报道了Bcap—37人乳腺癌细胞系在体内及体外对血卟啉衍生物(HPD)的吸收、分布与排泄。~3H—HPD经腹腔注入载瘤裸鼠体內后48—72小时,其体内分布含量依次为肝脏>脾脏>肾脏>小肠>肿瘤>皮肤>肌肉>脑组织>血液,表明HPD在体内不同器官的分布有差异性,对Bcap—37乳腺癌细胞有一定的亲和力,但并非特异性集聚于肿瘤组织。体外观察到HPD主要分布于Bcap—37乳腺癌细胞胞质内,细胞核对HPD无明显摄取,提示胞质内一些细胞器是光敏损伤的靶部位。     

bcl-2/bcl-xL反义寡核苷酸对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　观察靶向bcl 2 /bcl xL基因的反义寡核苷酸 (ASODN )对乳腺癌细胞株MCF 7增殖和凋亡的影响。方法　将bcl 2 /bcl xLASODN及其对照序列通过脂质体转染MCF 7细胞。采用MTT法测定MCF 7细胞增殖 ,荧光显微镜定量检测MCF 7细胞凋亡率。结果　与对照序列相比 ,bcl 2 /bcl xLASODN能抑制MCF 7增殖和诱导其凋亡 (P <0 .0 1)。结论　bcl 2 /bcl xLASODN在乳腺癌治疗方面作为 1种新的化合物值得进一步研究     

人NHE1 反义基因转染对SGC-7901 胃癌细胞增殖和凋亡的影响

 目的 探讨人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响，探索胃癌治疗的新方法。方法 采用脂质体法将构建好的人NHE1基因反义真核表达栽体转染至SGC-7901胃癌细胞中，比较观察细胞转染前后生长曲线、双层软琼脂克隆形成能力、裸鼠成瘤能力以及细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果 NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢，双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低，细胞凋亡率增加，裸鼠体内成瘤能力显著降低。结论 反义NHE1基因能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有良好的胃癌治疗效果，提示NHE1基因可成为胃癌治疗的新靶点，具有一定的临床应用前景。     

去磷酸化RB蛋白表达对阿霉素诱导MCF-7/S细胞凋亡的影响

目的检测经阿霉素(ADR)处理的人乳腺癌MCF-7/S细胞的凋亡率(AR)及去磷酸化RB蛋白表达的变化,以探讨ADR诱导细胞凋亡的可能机理。方法将体外培养的MCF-7/S细胞分为实验组(以不同浓度ADR处理细胞)及对照组(以等体积的生理盐水处理细胞);应用MTT比色法检测ADR对MCF-7/S细胞的抑制率(IR);应用流式细胞术检测实验组和对照组细胞的AR;采用S-P免疫组化染色法检测ADR作用后去磷酸化RB蛋白表达的变化。结果ADR抑制MCF-7/S细胞增殖,呈剂量依赖性,IC50为0.128mg/L;0.25、2、5μg/mlADR处理的MCF-7/S细胞的AR分别为0.171、0.184、0.259,而对照组MCF-7/S细胞的AR为0.045,两者比较,有非常显著性差异(P<0.01);5μg/mlADR实验组MCF-7/S细胞的去磷酸化RB蛋白的表达量为986.8±207.4,而对照组为131.7±31.9,两者比较,有非常显著性差异(P<0.01);5μg/mlADR实验组MCF-7/S细胞的AR与其去磷酸化RB蛋白的表达量呈正相关(γ=0.998,P=0.037)。结论ADR能抑制MCF-7/S细胞增殖并诱导其凋亡,其机理可能与去磷酸化RB蛋白表达水平上调有关。     

Cellular Effect of Curcumin and Citral Combination on Breast Cancer Cells: Induction of Apoptosis and Cell Cycle Arrest

Purpose

The unmanageable side effects caused by current chemotherapy regimens to treat cancer are an unresolved problem. Although many phytonutrients are useful as chemoprevention without side effects, their effects are slower and smaller than conventional chemotherapy. In the present work, we examined the cumulative effect of two phytonutrients, curcumin and citral, on breast cancer cell lines and compared their effect with the known chemotherapy regimen of cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil.

Methods

Using cultured breast cancer and normal epithelial cells, the cytotoxic and apoptotic effect of curcumin and citral was evaluated in vitro. The synergistic effect of curcumin and citral was calculated by a combination index study using the method by Chou and Talalay. Cell death pathways and mechanisms were analyzed by measuring intracellular reactive oxygen species (ROS) and apoptotic protein levels.

Results

Curcumin and citral caused dose and time dependent cell death and showed a synergistic effect at effective concentration EC₅₀ and above concentrations in breast cancer cells without disturbing normal breast epithelial cells. With combination curcumin and citral treatment, apoptosis induction and cell cycle arrest at G0/G1 phase in breast cancer cells were observed. Curcumin and citral generated ROS and activated p53 and poly (ADP-ribose) polymerase-1 mediated apoptotic pathways.

Conclusion

The results of this study suggest that curcumin and citral in combination may be a useful therapeutic intervention for breast cancer.     

重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响

 目的　研究BMP-2是否对胶质瘤细胞也具有诱导凋亡作用。方法　培养的人脑胶质瘤细胞系SHG-44中加入rhBMP-2,运用透射电镜观察凋亡的超微结构,流式细胞仪技术分析细胞DNA周期变化,琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的改变。结果　电镜下可见细胞核染色质浓缩、边集、核碎裂;DNA周期分析显示在G1期峰前存在一个凋亡峰(12.1%);DNA电泳呈梯状。结论　rhBMP-2在体外对人脑胶质瘤细胞系SHG-44有明显诱导凋亡的作用。     

吡柔比星为主方案治疗晚期乳腺癌517例的临床研究

对以ＴＨＰ及ＡＤＭ为主联合化疗治疗晚期乳腺癌疗效、毒性反应对比研究。方法：采用随机方法分析Ａ、Ｂ两组，Ａ组（ＴＨＰ组）３５７例，Ｂ组（ＡＤＭ组）１６０例。结果：Ａ组有效率达６３％，Ｂ组有效率５９．４％，Ａ组疗效略有增高，但两组之间无统计学差异，但Ａ组胃肠道反应，脱发，心脏毒性，明显低于Ｂ组。结论以ＴＨＰ为主联合方案治疗晚期乳腺，疗效高，毒性低，使用方便，价格适中，值得临床广泛推广应用。