丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

HL-60细胞中IL6基因的克隆及鉴定

目的：为探索性构建重组人白细胞介素６－绿脓杆菌外毒素融合蛋白（ＩＬ６－ＰＥ４０）以选择性杀伤高表达ＩＬ６受体（ＩＬ６Ｒ）的白血病细胞,本研究试图从人急性早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）中克隆Ｎ－末端缺失２４个氨基酸的人ＩＬ６基因（ＩＬ６ｃＤＮＡ）并构建含此基因的重组质粒。方法：根据ＩＬ６基因序列设计合成可扩增ＩＬ６ｃＤＮＡ的特异性引物;利用基因重组技术,构建含ＩＬ６基因的重组质粒ｐＵＣ－ＩＬ６。结果与结论：本文首次从ＨＬ－６０中扩增出预期４８０ｂｐ的ＩＬ６ｃＤＮＡ,将其克隆至ｐＵＣ１８质粒中,命名为ｐＵＣ－ＩＬ６,并经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切电泳及序列分析鉴定加以确证,为进一步构建重组人ＩＬ６－ＰＥ４０奠定了坚实基础。     

构建鼠IL—6反义RNA的逆转录病毒重组体

用限制性内切酶消化，提取鼠白细胞介素６ｃＤＮＡ全基因，并克隆至逆转录病毒穿梭质粒ｐＺＩＰ－ｎｅｏＳＶ（ｘ）ＢａｍＨＩ位点，经斑点杂交，限制性内切酶消化，电泳鉴定，证实成功地构建了表达鼠ＩＬ－６反义ＲＮＡ的逆转录病毒重组体，从而为研究白细胞介素６基因转移与治疗提代了物质基础。     

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

结核杆菌Ag85B DNA疫苗的制备及其免疫效应初探

将结核杆菌抗原Ａｇ85Ｂ基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ3中 ,构建成重组ｐｃＤＮＡ3 Ａｇ85Ｂ ,作为抗结核的ＤＮＡ疫苗 ,观察其对小鼠免疫应答的能力 ,为进一步研制抗结核疫苗提供依据。1 结核杆菌抗原Ａｇ85Ｂ真核表达载体的构建及在Ｃｏｓ 7细胞中的瞬时表达 :由本室构建的重组质粒ｐＵＣ1 8 Ａｇ85Ｂ ,经ＥｃｏＲⅠ /ＳａｌⅠ酶切 ,获得 860ｂｐＤＮＡ片段 ,插入经ＥｃｏＲⅠ /ＸｈｏⅠ酶切的载体ｐｃＤＮＡ3中 ,用ＨｉｎｄⅢ和ＸｈａⅠ酶切分析鉴定阳性克隆 ,获得表达载体ｐｃＤＮＡ3 Ａｇ85Ｂ。用 5μｇ纯化的重组质粒ｐｃＤＮ…     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

CLONING AND EXPRESSION OF cDNA FOR HUMAN LYMPHO-TOXIN

人淋巴毒素（ｈＬＴ）系由淋巴细胞经抗原或有丝分裂原活化后产生的一类细胞因子，它具有抗瘤、抗病毒活性和许多重要的免疫调节作用，是一种非常有前途的生物制剂。近年来发现的膜相关型淋巴毒素更提示ｈＬＴ可能具有尚未被揭示的免疫调节活性。因此，克隆人ＬＴｃＤＮＡ并在大肠杆菌表达重组ｈＬＴ，对于ｈＬＴ的开发利用和研究其功能都具有重要意义。本实验按照公布的ｈＬＴｃＤＮＡ序列，经计算机分析并结合实验要求设计并合成一对ＰＣＲ引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化２４ｈ的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ扩增出一５４１ｂｐＤＮＡ片段；经α－互补筛选，质粒小量快速抽提，限制性内切酶酶切鉴定，将该片段定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体。限制性内切酶图谱分析和Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法序列测定表明：该ＤＮＡ片段与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。它包括编码人淋巴毒素成熟肽的全部ｃＤＮＡ序列。再进一步将该ｃＤＮＡ片段克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０，经地高辛标记探针菌落原位杂交筛选，限制性内切酶酶切鉴定方向，筛选出一阳性重组子ｐＢＶ－ｈＬＴ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析表明：经温控诱导，该重组菌成功     

人白细胞介素ⅡcDNA表达载体的构建

为开展人白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）质粒基因肿瘤疫苗的研究,将经改造的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ与真核细胞表达ｐｃＤＮＡ３重组保到表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－２,该质粒转化大肠杆菌后,小量抽提获得的质凿经酶切分析显示长的６８０ｂｐ的目的ＤＮＡ（ＩＬ－２）已插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,说明成功构人白细胞介素ⅡｃＤＮＡ表达载体。     

Hyper-IL-6融合基因的构建及在真核细胞中的表达

目的： 构建融合基因Hyper-IL-6并在真核细胞中进行表达.方法： 采用基因拼接（GeneSOEing）法将人类可溶性白细胞介素6受体和白细胞介素6的编码基因用一富含甘氨酸序列的接头经PCR扩增融合, 并定向克隆至pIRES2-EGFP, 构建与绿色荧光蛋白（GFP）共表达的融合重组质粒, 转染哺乳动物细胞, 通过绿色荧光蛋白、 RT-PCR和免疫组化检测Hyper-IL-6蛋白的表达.结果： PCR扩增出1 224 bp的Hyper-IL-6编码序列并成功构建重组质粒pIRES-HIL-6, 重组质粒转染真核细胞后经检测证实Hyper-IL-6能在真核细胞中表达.结论： 人类Hyper-IL-6重组表达质粒的成功构建与真核表达为以后对其进行活性分析和生物学功能的研究提供了基础.     

Lhx8促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化

目的 构建大鼠Lhx8全长结构基因真核表达载体。方法 PCR法扩增Lhx8全长结构基因,经EcoRI和BamHI双酶切后连接至真核表达载体pEGFP-C3中,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8经测序鉴定后,采用脂质体转染的方法转染至体外培养的海马神经干细胞中。 结果 测序鉴定表明,重组质粒pEGFP-C3- Lhx8-EGFP构建成功,该重组质粒转入体外培养的神经干细胞后,质粒转染组中ChAT阳性的细胞数较阴性对照组明显增多（P<0.05）。 结论 重组质粒pEGFP-C3- Lhx8-EGFP构建成功,Lhx8能够促进NSCs向ChAT阳性的细胞分化。     

人IL-1RⅡ基因腺病毒载体的构建及在子宫内膜异位症细胞中的表达

目的：利用AdEasy XL系统，构建并鉴定IL-1RⅡ基因重组腺病毒载体，并在子宫内膜异位症（EM）细胞中表达。方法-PCR扩增含有IL-1RⅡ全长cDNA的片段，亚克隆到pShuttle—CMV穿梭质粒，经酶切和测序验证无误后，再经电转化与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒。经过抗性筛选、酶切鉴定以及再次测序验证无误后得到阳性的重组质粒，经PacⅠ酶切线性化再在293细胞中进行包装扩增，用ELISA检测IL-1RⅡ蛋白的表达。利用Adeasy XL系统的对照载体pShuttle-CMV-LacZ同上操作作为对照。收集的重组腺病毒感染原代培养的EM基质细胞，并以免疫组化法鉴定IL-1RⅡ表达。结果：测序证实连接后IL-1RⅡ序列完全正确；抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功；pShuttle-CMV-LacZ转染293细胞3d后x-gal染色阳性，回收病毒可以重复感染293细胞，ELISA鉴定表达IL-1RⅡ可溶性蛋白，证明病毒包装成功。重组的腺病毒感染EM基质细胞后，免疫组化法证实IL-1RⅡ表达。结论：成功地构建了IL-1RⅡ基因重组腺病毒载体，并且在EM基质细胞中表达，为进一步研究IL-1RⅡ基因在EM中的作用乃至生物治疗都奠定了基础。     

Molecular cloning and physical mapping of the genome of fish lymphocystis disease virus

A defined and complete gene library of the fish lymphocystis disease virus (FLDV) genome was established. FLDV DNA was cleaved with EcoRI, BamHI, EcoRI/BamHI and EcoRI/HindIII and the resulting fragments were inserted into the corresponding sites of the pACYC184 or pAT153 plasmid vectors using T4 DNA ligase. Since FLDV DNA is highly methylated at CpG sequences (Darai et al., 1983; Wagner et al., 1985), an Escherichia coli GC-3 strain was required to amplify the recombinant plasmids harboring the FLDV DNA fragments. Bacterial colonies harboring recombinant plasmids were selected. All cloned fragments were individually identified by digestion of the recombinant plasmid DNA with different restriction enzymes and screened by hybridization of recombinant plasmid DNA to viral DNA. This analysis revealed that sequences representing 100% of the viral genome were cloned. Using these recombinant plasmids, the physical maps of the genome were constructed for BamHI, EcoRI, BestEII, and PstI restriction endonucleases. Although the FLDV genome is linear, due to circular permutation the restriction maps are circular.     

携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。     

Preliminary study on mouse interleukin-21 application in tumor gene therapy

lnterleukin-21(IL-21)is a recently characterized T cell-derived cytokine with a significant homology to IL-2,IL-4 and IL-15.To determine whether IL-21 has broad immunoregulatory activity and can stimulate durableantitumour responses,we constructed mouse IL-21(mIL-21) recombinant plasmid and evaluated its antitumorefficacy.Mouse IL-21 cDNA was amplified from Con A-activated mouse T cells by RT-PCR.RecombinantpcDNA3.1/mIL-21 was constructed and transfected into Sp2/0 cells.Mouse IL-21 expression was analyzed byWestern blotting and its activities were detected by ~3H-TdR incorporation and MTT assay.The recombinantpcDNA3.1/mIL-21 was injected s.c.into tumor lump.Tumor size,weight,the activities of CTLs,NK cells andLAK cells and serum IFN-γ,level were measured for evaluating mIL-21 mediated antitumor responses.Theresults indicated that mIL-21 was correctly expressed in Sp2/0 cells and it can improve the proliferation of Tcells and B cells,and enhance NK cytotoxic activity in vitro.The activities of CTL and NK cells,and serumIFN-γlevel were significantly improved,furthermore the tumor growth was obviously suppressed inpcDNA3.1/mIL-21 treated mice.However,the LAK activity did not alter significantly.Taken together,thisstudy suggests that the injection with recombinant plasmid containing mIL-21 is a potential approach fortumor gene therapy.Cellular & Molecular Immunology.2004;1(6):461-466.     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

共表达HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6重组鸡痘病毒的筛选

目的构建共表达中国株HIV1gaggp120与白细胞介素6(IL6)的重组鸡痘病毒(FPV)。方法分别将HIV1gaggp120基因和IL6基因插入到FPV表达质粒pUTAL复合启动子和单一启动子下游,构建重组FPV表达质粒pUTAGEIL6。利用脂质体法将重组质粒和FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,经BUdR加压筛选,重组病毒分别用SDSPAGE和WesternBolt进行鉴定,观察病毒样粒子的形成和重组病毒在哺乳动物细胞中的表达,并分析其免疫原性。结果阳性重组病毒基因组点膜处有显色斑点,WesternBolt结果显示重组病毒表达了gaggp120嵌合蛋白和IL6,在病毒感染细胞中有反转录病毒样粒子形成,且重组病毒可在哺乳动物细胞中表达目的蛋白。小鼠免疫指标检测表明该重组病毒具有很好的免疫原性。结论成功构建了共表达中国株HIV1gaggp120与IL6的重组FPV,为HIV-1基因工程活载体疫苗和巨分子颗粒化疫苗的制备奠定了基础。     

人生长激素基因在小鼠体内的表达及其对血清中细胞因子浓度的影响

目的 :探讨体内高水平的人生长激素 (GH)对机体免疫功能的影响。方法 :构建人GH基因的真核表达质粒pcDNA3 hGH ,直接注射于小鼠的股四头肌中。注射后分别在第 5、15、2 5天分离血清 ,通过ELISA方法检测血清中GH的水平 ,同时检测血清中IL 2、IFN γ和TNF α水平的变化。结果 :所构建的质粒目的基因插入正确 ,转染细胞能分泌高水平的GH。接受质粒的小鼠血清中人GH的浓度与对照组相比较明显提高 ,但IL 2、IFN γ和TNF α的浓度没有显著变化。结论 :体内较高水平的GH对IL 2、IFN γ和TNF α的分泌没有显著影响