融合表达β趋化因子受体5NH2端膜外第一襻及其特异抗体F(ab′)2的制备

目的：研究β趋化因子受体５（ＣＣＲ５）ＮＨ２端膜外第一襻结构域的功能及其特异抗体Ｆ（ａｂ′）２的制备。方法：计算机分析趋化因子超基因家族,定位超基因家族中同源顺序最低的结构域ＮＨ２端膜外结构域,ＰＣＲ扩增出该结构域１１４个核苷酸序列。构建融合表达载体ｐＧＥＸ－ＩＮ／ＮＲ５,经测序鉴定正确后,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,经纯化后免疫新西兰兔。蛋白Ａ亲和层析和胰蛋白酶消化ＩｇＧ,经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－１２柱层析制备Ｆ（ａｂ′）２。结果：经还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＦＡＸ分析证明得到抗ＣＣＲ５ＮＨ２端的特异性抗体。结论：本方法为一简捷快速的特定功能结构域抗体Ｆ（ａｂ′）２制备方法,对研究该基因在体内的表达及生物学功能提供了重要的实验材料,同时也对超基因家族中亚家族特异抗体研制提供了一种研究思路和方法。     

融合表达β趋化因子受体5NH2端膜外第一襻及其特异抗体F(ab'''')2的制备

目的：研究β趋化因子受体５（ＣＣＲ５）ＮＨ２端膜外第一襻结构域的功能及其特异抗体Ｆ（ａｂ‘）２的制备。方法;计算机分析趋化因子超基因家族,定闰超基因家族中同源顺序最低的结构域ＮＨ２端膜外结构域,ＰＣＲ扩增出该结构域１１４个核苷酸序列。     

人趋化因子受体5 N端膜外第一襻的克隆与表达及其特异抗体的制备

目的：获得人β趋化因子爱体5(huCCR5)N端膜外第一襻基因片段的序列，并构建表达huCCR5N端膜外第一襻的重组体，实现其有效表达及其特异抗体的鉴定。方法：计算机分析比较趋化因子超家族部分成员，定位超家族中同源性最低的N端膜外第一襻结构域，PCR扩增出该结构域114个核酸序列基因片段，构建融合表达载体pGEX-IN/NR5,经测序确定基因片段正确后，在大肠杆菌中表达。表达产物经纯化后免疫新西兰兔。ELISA鉴定CCR5N端肽段特异性抗体。结果：序列测定结果与献报道一致，经计算机作图分析ELISA实验数据证明得到抗huCCR5N端肽段的特异性抗体。结论：本方法采用pGEX-IN在大肠杆菌DE3中有效表达CCR5N端膜餐第一襻基因片段，并实现了对其特异性抗体的鉴定，为进一步的研究奠定基础。     

抗竹叶青蛇毒抗体F(ab′)2的制备

目的：制备特异性强、高纯度的抗竹叶青蛇毒抗体F（ab′）2。方法：以竹叶青蛇毒为免疫原免疫马,试血效价达到要求后,从免疫马血浆中先提取IgG,然后酶解、过疏水柱后得到F（ab′）2片段,以免疫扩散实验检测抗体F（ab′）2片段的特异性,以小鼠中和试验测定其中和竹叶青蛇毒的能力。结果：纯化得到的F（ab′）2活性片段纯度可达90%;F（ab′）2冻干品与竹叶青蛇毒在8∶1时出现免疫沉淀线,在20∶1时可保护小鼠100%存活。结论：纯化得到的抗体F（ab′）2活性片段对竹叶青蛇毒具有较好的中和能力。     

抗内毒素鸡蛋黄抗体F(ab′)_2制备

目的研究抗内毒素鸡蛋黄免疫球蛋白(IgY)用胃蛋白酶切后提取的F(ab′)2片段,探索防治内毒素血症的新途径。方法用内毒素(LPS)作抗原免疫25周龄leghorn鸡,改良水溶法提取抗内毒素IgY,胃蛋白酶切后提取IgY F(ab′)2段,光密度法测抗内毒素IgY F(ab′)2浓度和含量、ELISA检测抗内毒素IgY F(ab′)2效价,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量及纯度。结果抗内毒素IgY F(ab′)2含量为1.04mg/ml蛋黄液,效价为1∶25600,纯度为90%,相对分子质量为24000。结论抗内毒素IgY F(ab′)2产量大、效价高、特异性强。     

人趋化因子受体5基因的克隆及原核表达

目的：构建人趋化因子受体5（CCR5）原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：从健康人外周血单个核细胞提取总RNA,以RT—PCR获得CCR5基因全长1059bp的完整编码序列;将其克隆入载体pGEM—T中,经限制性内切酶和菌落PCR分析并测序;再将阳性重组子中的CCR5片段与表达载体pQESOL连接并转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,对表达产物进行纯化和鉴定。结果：SDS—PAGE和WesternBlot分析表明,在30℃以IPTG诱导获得相对分子质量为41000的CCR5重组蛋白表达带,诱导4h后此蛋白表达量约为全菌总蛋白的25％。结论：成功获得人CCR5重组蛋白。     

转录激活因子AP-2β基因的克隆、表达及其抗体的制备

目的：克隆、表达与纯化出AP—2β蛋白质，并用所表达的蛋白质制备出抗AP—2β的抗体。方法：将AP—2β基因插入到表达载体pGEX—4T—1谷胱苷肽—S—转移酶基因下游，所得克隆经测序，以确定其阅读框码的正确性，然后用正确的克隆质粒转化E．coli BL21，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，而后用谷胱苷肤琼脂糖—4B纯化所表达的融合蛋白质。通过凝胶迁移率变动分析实验(EMSA)测得蛋白质的生物学活性，所得蛋白质用于制备抗体。结果：得到一条大约78KD的蛋白质，并且成功的制备了抗体，所得蛋白质和抗体均具有很好的生物学活性。结论：我们成功的表达出转录激活因子AP—2β并制备出抗AP—2β的抗体，为一下步对AP—2β的功能进行研究打下了良好的基础。     

CXC 趋化因子受体5及其配体 CXCL13在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的：研究 CXC 趋化因子受体5（CXCR5）及其配体 CXCL13在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其临床意义。方法采用荧光定量聚合酶链式反应法（FQ －PCR）和蛋白印记法（Western blot）检测37例 NSCLC患者癌组织及癌旁组织和21例非炎性正常肺组织 CXCR5及其配体 CXCL13 mRNA 及蛋白的表达。结果FQ －PCR 及 Western blot 结果显示,癌组织中 CXCR5及其配体 CXCL13 mRNA 及蛋白表达水平均明显高于相应癌旁组织（mRNA：2．92±0．31 vs．1．16±0．18 和2．46±0．28 vs．1．07±0．20,P ＜0．01;蛋白：1．93±0．21 vs．0．93±0．11和2．13±0．33 vs．1．07±0．21,P ＜0．01）。 CXCR5与 CXCL13 mRNA 及蛋白的表达呈正相关（mRNA：r ＝0．648,P ＜0．01;蛋白：r ＝0．669,P ＜0．01）。癌组织 CXCR5与 CXCL13 mRNA 及蛋白阳性表达率显著高于相应癌旁组织（P ＜0．01）,且癌组织 CXCR5及 CXCL13 mRNA 和蛋白的表达与肿瘤类型、肿瘤分化程度、是否有淋巴结转移和肿瘤 TNM分期有关（P ＜0．05）;而正常肺组织中均无 CXCR5与 CXCL13 mRNA 及蛋白的表达。结论CXCR5与 CXCL13在NSCLC 患者癌组织、癌旁组织中均高表达,其协同作用可能参与 NSCLC 的发生及发展过程。     

GST-Gankyrin融合蛋白的原核表达及抗体制备

目的:为进一步研究在肝癌上过表达的癌相关基因Gankyrin的功能,进行GST-Gankyrin融合蛋白表达载体的构建、原核表达、及抗体制备.方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人肝癌细胞系hepG2中扩增Gankyrin Cdna编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒Pgex-4T2中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌DH-5α,经IPTG诱导获得表达,并将Gankyrin蛋白免疫家兔,经过Western blot检测抗Gankyrin抗体的产生.结果:成功构建了Gankyrin原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,Western blot检测证实获得了抗Gankyrin抗体.结论:成功表达了Gankyrin蛋白并制备了其特异性抗体.     

抗激活素受体相互作用蛋白1抗体的制备及应用

目的：制备抗激活素受体相互作用蛋白 1(ARIP1)抗体并探讨其应用。方法： 在大肠杆菌BL21中表达GST-ARIP1融合蛋白,以该蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,制备抗ARIP1的多克隆抗体。应用该抗体进行免疫组织化学染色,分析ARIP1在小鼠脑组织的分布。结果：制备的兔抗ARIP1多克隆抗体可以特异识别ARIP1,而与ARIP2无交叉反应。初步应用制备的抗体进行免疫组织化学染色,ARIP1在小鼠大脑组织主要表达在下丘脑及海马。结论：成功地制备了抗ARIP1多克隆抗体,该抗体可用于ARIP1成熟蛋白表达的免疫组织化学染色分析。     

抗β2—受体自身抗体在心肌梗死急性期的动态变化

目的:了解抗β2-受体的自身抗体在急性心肌梗死(AMI)时的变化规律.方法:以合成的人心脏β2-受体细胞外第二环表位肽段172-197氨基酸序列作为抗原,应用酶联免疫吸附(ELISA)方法,检测41例AMI患者,发病24小时、7天、2～4周时,血清中抗β2-受体自身抗体的阳性率,并与61例正常人的检测结果进行对比.结果:心肌梗死患者急性期抗β2-受体自身抗体的阳性率显著高于对照组(P＜0.05);心肌梗死发病24小时时抗β2-受体自身抗体的阳性率(29.3%)明显低于发病2～4周时(56.1%)的检测结果(P＜0.05);心肌梗死急性期心功能killip-1级者与killip-2级者比较,抗β2-受体自身抗体的阳性率无显著性差异.结论:抗β2-受体自身抗体存在于AMI患者血清中,且在发病2～4周内逐渐升高.该抗体的产生与心肌梗死急性期心功能状态无明显的相关性.     

趋化因子受体5及其基因多态性△32与乳腺癌相关性的研究

目的研究乳腺癌组织及腋窝淋巴结中趋化因子受体5（CCR5）的表达和基因多态性CCR5一A32的发生频率,探讨其在乳腺癌转移中的作用。方法收集2008年8月至2009年6月聊城市人民医院乳腺甲状腺外科手术切除的组织标本35例,采用实时荧光定量RT—PCR法检测乳腺癌原发癌灶及其腋窝淋巴结、癌旁组织和乳腺纤维腺瘤组织中CCR5mRNA相对表达量,及CCR5一A32等位基因发生频率。数据采用单因素方差分析及独立样本t检验。结果①乳腺癌组织CCR5mRNA的相对表达量显著高于癌旁正常组织（P〈0．01）及良性肿瘤组织（P〈0．05）,Ⅱ期与Ⅲ期乳腺癌组织CCR5mRNA相对表达量差异有统计学意义（P〈0．05）,癌旁正常组织与纤维腺瘤组织CCR5mRNA的相对表达量差异无统计学意义（P〉0．05）;②转移淋巴结组织CCR5mRNA的相对表达量明显高于非转移淋巴结（P〈0．05）;（奶5例均未发现等位基因CCR5一A32的变异;④乳腺癌组织CCR5mRNA的相对表达量与ER、PR等临床免疫指标无相关性,但与有无腋窝淋巴结转移及C—erbB一2表达相关。结论CCR5在乳腺癌组织及转移淋巴结中的表达明显升高,CCR5与其配体结合促进了乳腺癌的发生发展及腋窝淋巴结的转移,可作为预测引障瘸腑蜜激p结弦稳砖而后的舌算锌千粽士物柏I瞻市治疗焊枇了拓苗Ⅲ占     

单链抗体及重组白介素-2双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,并探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤单链抗体(scFv)基因5′端,其3′与白介素-2(IL-2)基因连接构成分泌型单链双功能抗体scFv-IL-2基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(scFv-IL-2)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/scFv-IL-2,以PCR,RT-PCR以及Western blotting对scFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定。在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAs-sist和蛋白质分析软件ANTHEPROTV5分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。结果经酶切、PCR及Western blotting分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(scFv-IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26,scFv-IL-2融合蛋白通过DNAssist和ANTHEPROTV5软件分析获得了融合蛋白的二级结构及其理化性质。结论利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。     

Glycodelin －A 对 CD4＋T 细胞表达趋化因子受体的影响

目的：通过研究妊娠相关蛋白－A（Glycodelin －A）对 CD4＋T 细胞表达趋化因子受体的影响,探讨Glycodelin －A 影响 CD4＋T 细胞的可能机制。方法抽取正常育龄女性外周血,将全血加入不同浓度 Glycodelin －A 后于体外环境下分别培养6、24、48 h。多重荧光标记后利用流式细胞术（FCM）分析 CD4＋T 细胞表面 CXCR4、CCR2、CCR5表达率。结果Glycodelin －A 对 CD4＋T 表达 CXCR4表达无明显调节作用,适宜浓度下对 CD4＋T 表达 CCR2起上调作用,对 CD4＋T 表达 CCR5起下调作用。结论Glycodelin －A 可通过改变 CD4＋T 细胞表达趋化因子受体 CCR2、CCR5表达影响 CD4＋T 细胞功能。     

神经干细胞移植对脑缺血再灌注损伤大鼠CXC趋化因子1和2及其趋化因子受体2表达的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脑缺血再灌注损伤梗死区CXC趋化因子1(CXCL1)和CXC趋化因子2(CXCL2)及CXC趋化因子受体2(CXCR2)表达的影响。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型,实验动物随机分为假手术组、模型组和NSCs组。NSCs组尾静脉注射PKH26标志的NSCs细胞悬液,缺血72 h后行神经功能损害评分(NSS),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法检测脑梗死体积,苏木精-伊红(HE)染色观察梗死区病理变化,Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测梗死区CXCL1、CXCL2、CXCR2蛋白和mRNA表达。结果脑缺血后72 h,模型组和NSCs组NSS评分和脑梗死体积高于假手术组(P<0.05);NSCs组NSS评分和脑梗死体积低于模型组(P<0.05)。HE染色可见模型组梗死区大量炎性细胞浸润,而NSCs组梗死区炎性细胞浸润较少;NSCs组在梗死区有红色荧光信号表达,而假手术组和模型组未发现红色荧光信号。模型组CXCL1、CXCL2、CX-CR2蛋白和mRNA相对表达高于假手术组(P<0.05);NSCs组CXCL1、CXCL2、CXCR2蛋白和mRNA相对表达低于模型组(P<0.05)。结论 NSCs移植具有促进脑缺血损伤神经功能恢复和减少脑梗死体积的作用,其机制可能与其下调炎症趋化因子CXCL1、CXCL2及其受体CXCR2表达、进而抑制炎症反应有关。     

趋化因子受体5在乳腺浸润性导管癌组织的表达及意义

目的:探讨趋化因子受体5(CCR5)在乳腺浸润性导管癌组织的表达及意义方法:采用酶标记免疫组织化学方法检测30例乳腺浸润性导管癌及10例乳腺良性肿瘤组织中CCR5的表达情况,并应用ELISA双抗体夹心方法检测了相应患者血清中相关趋化因子MIP1α,MIP1β及RANTES的含量.结果:在乳腺浸润性导管癌组织检测到CCR5的表达(16/30,表达率53.3%),而乳腺良性肿瘤组织中无1例表达;与乳腺良性肿瘤患者相比,在乳腺浸润性导管癌患者血清中RANTES含量明显升高[(41.8±10.2) vs (16.5±2.4) ng/ml,P<0.01],而MIP1α,MIP1β无明显变化.结论:在人乳腺浸润性导管癌组织上发现CCR5的表达,其在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用,而RANTES可能是与其相互作用的主要配体.     

人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体β基因(PILRβ)的克隆、表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体蛋白PILRβ,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:应用RT-PCR从人的外周血细胞总RNA中反转录并扩增出PILRβ基因,将其克隆到表达载体pET-32a,在大肠杆菌中IPTG诱导表达,经Ni2 -NTA亲和层析柱纯化,纯化后的蛋白多次注射免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体特异性.结果:获得了较高纯度的PILRβ蛋白(Mr约为42 000)及其抗体,多抗效价达到1:10 000,且特异性较好.结论:成功克隆了PILRβ基因并表达纯化了其蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究PILRβ蛋白的功能和潜在的药物开发打下了基础.     

EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶（GST）-Rta185和GST-Rta150,并制备特异性多克隆抗体。方法 质粒表达载体pGEX-R185I、pGEX-R150I和pGEX-5X-3分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白。将纯化后的GST-R185、GST-R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清。结果 在细菌裂解液中检测到高表达量的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-Rta融合蛋白。应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST-Rta蛋白免疫家兔得到了特异性的多克隆抗体。结论 通过上述方法制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件。     

抗Her-2抗体与人β防御素Ⅱ融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

利用小分子泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier,SUMO）融合表达系统,在大肠杆菌Origami B（DE3）中表达人β防御素Ⅱ（human β defensin 2,HBD2）与抗人表皮生长因子受体2（Her-2）单链抗体（4D5 scFv）的融合蛋白。经20 ℃,l mmol/L IPTG诱导24 h后,获得相对分子质量约为41 kD的SUMO-HBD2-4D5融合蛋白,为可溶性表达,表达量占菌体上清总蛋白的42.2%。利用组氨酸亲和凝胶色谱（Ni-NTA sepharose）、特异性SUMO蛋白酶（SUMO protease）酶切和分子筛（Sephadex G-25）联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白HBD2-4D5,其最终得率达到15 mg/L。HBD2-4D5 200μg对金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌K12D31具有较明显的杀伤作用。免疫荧光分析结果显示,HBD2-4D5蛋白能结合于Her-2高表达的人乳腺癌细胞SK-BR-3表面。本实验表达的HBD2-4D5双功能蛋白具有较好的抗菌活性和特异性结合SK-BR-3表面Her-2的能力,为日后用于靶向治疗Her-2高表达的肿瘤疾病提供研究基础。     

肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗强直性脊柱炎的护理

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一种原因不明的以中轴关节慢性非特异性炎症为主的全身性结缔组织疾病,也是一种常见的慢性致残性风湿病,其患病率为0．3％左右,主要累及骶髂关节、脊柱和髋关节,发病者主要为青年男性,疾病晚期可发生脊柱强直、畸形以致严重功能受损。AS目前尚元根治的方法,肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白（TNFR：FC）作为一种生物制剂,