人间质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病的实验

目的：观察人胚间质干细胞移植至缺氧缺血性脑病新生大鼠后对其学习记忆能力的改善效果。 方法：7窝SD新生1d大鼠共81只，同窝随机分为正常对照组、间质千细胞组、生理盐水组和未治疗组4组。①后3组大鼠左颈动脉结扎，吸入体积分数为0．08的氧制作缺氧缺血性脑病模型；间质干细胞组脑定位注射分离培养的中期引产人胚胎（获供者知情）骨髓间质干细胞，每点注射2μL（细胞浓度为2&;#215;10^11L^-1）；生理盐水组同法注射等量生理盐水。观察各组新生大鼠1周内成活率。②移植后第6周对同窝4组大鼠进行Morris水迷宫训练，4d后进行测试，以找到平台的时间代表大鼠学习和记忆能力。③移植后第10周麻醉后处死实验鼠，苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测骨髓间质干细胞在大鼠脑内存活和分化情况。 结果：①组新生大鼠1周内成活率比较：间质干细胞组明显高于生理盐水组和未治疗组[75．0％（15／20），35．3％（6／17）50．0％（7／14），P〈0．01]，而与正常对照组比较差异不显著（P〉0．05）。②4组新生大鼠水迷宫实验结果：间质干细胞组大鼠找到平台的时间明显短于生理盐水组和未治疗组（P〈0．01）；训练3d后与正常对照组差异不显著。（3）4组新生大鼠免疫荧光检测结果：间质千细胞组中，进针注射部位存在大量移植细胞，并向周围迁移，皮质层、海马等部位检测到移植细胞；所植入的细胞约6％表达胶质纤维酸性蛋白，约8％表达神经特异性烯醇化酶。 结论：移植人胚胎骨髓间质干细胞能提高缺氧缺血性脑病新生大鼠存活率，改善其学习记忆能力。间质干细胞在鼠脑内最少可以存活10周。     

人间质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病的实验

目的:观察人胚间质干细胞移植至缺氧缺血性脑病新生大鼠后对其学习记忆能力的改善效果。方法:7窝SD新生1d大鼠共81只,同窝随机分为正常对照组、间质干细胞组、生理盐水组和未治疗组4组。①后3组大鼠左颈动脉结扎,吸入体积分数为0.08的氧制作缺氧缺血性脑病模型;间质干细胞组脑定位注射分离培养的中期引产人胚胎(获供者知情)骨髓间质干细胞,每点注射2μL(细胞浓度为2×1011L-1);生理盐水组同法注射等量生理盐水。观察各组新生大鼠1周内成活率。②移植后第6周对同窝4组大鼠进行Morris水迷宫训练,4d后进行测试,以找到平台的时间代表大鼠学习和记忆能力。③移植后第10周麻醉后处死实验鼠,苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测骨髓间质干细胞在大鼠脑内存活和分化情况。结果:①4组新生大鼠1周内成活率比较:间质干细胞组明显高于生理盐水组和未治疗组[75.0%(15/20),35.3%(6/17)50.0%(7/14),P<0.01],而与正常对照组比较差异不显著(P>0.05)。②4组新生大鼠水迷宫实验结果:间质干细胞组大鼠找到平台的时间明显短于生理盐水组和未治疗组(P<0.01〉;训练3d后与正常对照组差异不显著。③4组新生大鼠免疫荧光检测结果:间质干细胞组中,进针注射部位存在大量移植细胞,并向周围迁移,皮质层、海马等部位检测到移植细胞;所植入的细胞约6%表达胶质纤维酸性蛋白,约8%表达神经特异性烯醇化酶。结论:移植人胚胎骨髓间质干细胞能提高缺氧缺血性脑病新生大鼠存活率,改善其学习记忆能力,间质干细胞在鼠脑内最少可以存活10周。     

黄芩苷协同人脐血间充质干细胞静脉移植治疗幼鼠缺氧缺血性脑损伤

背景:最近研究证实黄芩苷对多种脑损伤具有广泛的神经系统保护作用.目的:探讨中药单体黄芩苷干预并协同人脐血间充质干细胞静脉移植治疗幼鼠缺氧缺血性脑损伤的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-02/2008-01在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.材料:健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,取自南昌大学一附院产科.清洁级7 d龄SD新生鼠85只,随机分为正常对照组15只、模型组20只、细胞移植组25只、细胞移植+黄芩苷组25只.方法:采用明胶沉降+密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,体外扩增至第5代用于移植,使用前6-12 h行DAPI标记.模型组、细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组新生鼠建立缺氧缺血性脑损伤模型,空白对照组不作任何处理.分别于造模后2,3,4,5周,细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组经尾静脉注射DAPI标记好的人脐血间充质干细胞悬液5～10 μL/g,细胞浓度为1×10~9L(-1).从细胞移植第1天起,细胞移植+黄芩苷组动物经腹腔注射120 mg,kg黄芩苷,1次/d,连续3 d.主要观察指标:脑组织病变情况,脑组织DAPI阳性细胞数,脐血间充质干细胞移植后定位情况.结果:移植后4周,细胞移植+黄芩苷组脑组织病变率明显低于模型组、细胞移植组(P<0.05).与细胞移植组比较,第1,2,4周细胞移植+黄芩苷组DAPI阳性细胞数均显著增加(P<0.01).造模后第3周开始细胞移植的病灶脑组织,在黄芩苷的协同作用下可见大量DAPI阳性细胞集中分布于病灶区周围,与宿主脑整合,没有明显的界限,而对侧非缺血区很少见到DAPI阳性的脐血间充质干细胞分布;造模后第4,5周开始细胞移植的病灶脑组织,其DAPI阳性细胞明显减少.结论:选择缺氧缺血性脑损伤后第3周进行细胞移植效果较佳,黄芩苷能够协同人脐血间充质干细胞有效地透过血脑屏障,在病灶脑组织周围迁移、扩散、整合.     

人脐血单个核细胞移植在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的迁移及分化

背景:研究发现脐血单个核细胞脑内移植后可以存活,并减轻缺氧缺血性脑损伤程度,显著改善脑损伤大鼠的远期行为学,但作用机制仍未阐明.目的:将人脐血单个核细胞绎侧脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内,观察植入细胞在脑内的迁移与分化.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2007-12/2008-08在潍坊医学院分子影像学研究中心完成.材料:脐血来源于健康、足月妊娠产妇,由潍坊医学院附属医院产科提供.清洁级健康7 d龄SD新生大鼠50只,由山东省中医药大学动物中心提供.方法:Ficoll法体外分离培养人脐血单个核细胞,移植前3 d行BrdU标记.50只大鼠均采用Rice-Vannucci法复制缺氧缺血性脑损伤模型,造模后24 h,在左侧侧脑室(AP:-0.5 mm,ML:-2 mm,DV:-2 mm)注入脐血单个核细胞悬液,2 μL点,共1×105个活细胞.分别干细胞移植后24 h,3 d,7 d,14 d,28 d取材制备脑组织切片,10只,时间点.主要观察指标:采用免疫荧光双标法检测移植脐血单个核细胞的脑内迁移、神经干细胞的表达、分化情况.结果:50只大鼠均进入结果分析.①移植后24 h侧脑室内可见BrdU+细胞;移植后3,7 d移植细胞迁移到室管膜下区;移植后14,28 d移植细胞迁移到大脑皮质及海马.②移植后24 h侧脑室内可见BrdU+nestin+细胞:移植后3 d室管膜下区出现BrdU+nestin+细胞;移植后7 d BrdU+nestin+细胞数增加;移植后14 d BrdU+nestin+细胞数下降.③移植后14 d大脑皮质、海马开始出现BrdU+NSE+细胞与BrdU+GFAP+细胞,移植后28 d双阳性细胞数进一步增加,BrdU+NSE+细胞及BrdU+GFAP+细胞占BrdU+的比例也增加.结论:脐血单个核细胞侧脑室移植入脑内后可以继续存活,并迁移到大脑皮质与海马部位,分化为成熟的神经元与神经胶质细胞.     

人胚胎骨髓间质干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病的实验

目的：在制作新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型基础上，研究间质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病的应用前景。 方法：实验于2002-09／2004-03在深圳宝安血站干细胞研究实验室内完成。实验中采用L-DMEM分离培养骨髓中间质干细胞。7窝SD 1d龄新生大鼠共81只同窝随机分为4组：①正常组，不干预。②模型组：结扎左颈动脉，吸氧3h制成缺氧缺血性模型。③生理盐水组：造模后24h定位注射生理盐水8μL。④间质干细胞组：处理同生理盐水组，注射间质干细胞（1．0～2．0）&;#215;10^6／μL。Morris水迷宫试验评估移植后第42天大鼠学习和记忆能力；第10周麻醉状态下处死实验鼠，制作病理切片，苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测间质干细胞在脑内存活和分化情况。 结果：①第1周内成活率：第7天，81只实验鼠存活42只，间质干细胞组与正常对照组大鼠存活率分别为75．0％和82．4％，差异不显著；明显高于生理盐水组（35.3％）和模型组（50．0％）（P〈0．01）。②水迷宫试验显示间质干细胞组大鼠的空间识别和记忆能力明显优于生理盐水组和模型组（P〈0．01）；培训后第5天，间质干细胞组识别平台的平均时间为7．5s，与正常组7．0s不存在差异。③病理切片、苏木精-伊红染色和间接免疫实验结果显示：间质干细胞移植组中，进针注射部位存在大量移植细胞，并向周围迁移，皮质层、海马等部位检测到移植细胞；所植入的细胞约6％表达胶质纤维酸性蛋白，约8％表达神经元特异性烯醇化酶。结论：移植人间质干细胞组能有效修复缺氧缺血导致的神经受损，改善其功能，明显提高缺氧缺血性脑损伤大鼠1周内成活率。     

大鼠骨髓间质干细胞修复缺氧／缺血性脑损伤的研究

目的 观察大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)移植对缺氧/缺血性脑损伤的修复作用.方法 从大鼠骨髓中分离rMSCs进行培养扩增.制备缺氧/缺血性脑损伤大鼠模型,制模后第3日进行经5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的rMSCs脑内移植.移植后7、14、21、30 d进行Y迷宫实验检测大鼠的学习和记忆保持能力;另取脑组织进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化,观察rMSCs对大鼠脑损伤的修复情况及rMSCs在脑内的定位.结果 Y迷宫实验发现rMSCs移植组在各个时间点学习和记忆保持能力都优于模型组和PBS对照组(P均<0.01).HE染色发现缺氧/缺血性脑损伤模型大鼠主要表现为皮质、海马神经元变性、坏死,神经胶质细胞增生,胶质瘢痕形成.rMSCs移植后损伤脑组织得到不同程度的修复,移植的rMSCs在脑内存活,并主要迁移到皮质、海马等损伤部位.结论 rMSCs移植对缺氧/缺血性脑损伤大鼠模型的学习和记忆保持能力的恢复具有显著的促进作用;其作用与移植的rMSCs向脑损伤部位的迁移和植活有关.     

胎盘间充质干细胞治疗大鼠缺氧缺血性脑病的实验研究

目的:探讨胎盘间充质干细胞(PDMSCs)治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIBD)的效果及其机制。方法:Wistar大鼠随机分为对照组、HIBD组、HIBD+PDMSCs组和HIBD+成纤维细胞组。移植后14d评估各组生长发育情况、神经功能,分别采用RT-PCR法、Western Blot法检测损伤侧海马组织的血红素加氧酶-1(HO-1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)的基因和蛋白表达。结果:HIBD+PDMSCs组脑萎缩、神经行为障碍均改善,且体重显著升高,与对照组比较有明显差(P<0.05)。HIBD组HO-1和Nrf2的基因和蛋白表达均高于对照组(P<0.05),HIBD+PDMSCs组二者含量均较HIBD组明显增加(P<0.05),HIBD+成纤维细胞组的各项指标与HIBD+PDMSCs组相比均有统计学差异(P<0.05)。结论:PDMSCs移植能够改善新生HIBD大鼠的神经功能和发育,可能是通过部分上调Nrf2/ARE/HO-1通路发挥作用。     

脐血间充质干细胞静脉移植治疗缺氧缺血性脑损伤的时效性

背景:研究证实,使用间充质干细胞移植治疗成年动物缺氧缺血性脑损伤已取得了一定的疗效,但新生动物模型较少见.治疗所使用的间充质干细胞基本上都来源于骨髓,使用脐血间充质干细胞的研究报道较少.目的:将脐血间充质干细胞从尾静脉注入新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型,探讨脐血间充质干细胞移植治疗的可行性及时效性.设计、时间和地点:完全随机对照的动物实验,于2004-10/2005-07在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.材料:选用健康新生7 d龄SD大鼠38只制作新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型,死亡3只.方法:采集23～35岁健康孕妇足月顺产儿的脐带血体外培养脐血间充质干细胞.移植前应用4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸体外标记间充质干细胞.造模成功的35只大鼠随机分为3组:早期移植组12只造模后第2天经鼠尾静脉注入脐血间充质干细胞:晚期移植组 12只造模后1周进行移植;对照组11只注射等量的生理盐水.早期移植组和晚期移植组于移植后第2天以及造模后2周分别随机取6只大鼠,对照组于造模后2d,1和2周分别取3,4,4只大鼠麻醉后处死.取脑和海马回区的缺血脑组织制作冰冻切片.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察脑组织病理形态学改变.荧光显微镜观察脑组织4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸阳性细胞.结果:对照组缺血区脑水肿,神经细胞肿胀,细胞数减少;早期移植组于移植后病灶侧脑内很少见到4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸阳性脐血间充质干细胞分布,其脑组织水肿程度及细胞外间隙的改善和细胞数目的增加也不明显;晚期移植组,造模后1周缺血脑组织细胞外间隙缩小,细胞数明显增加,脑组织水肿已明显减轻,在大鼠病灶侧脑内,可见大量的4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸阳性细胞向病灶区及周围迁移和扩散,没有明显的界限.结论:脐血间充质干细胞能有效透过血脑屏障,在病灶脑组织周围迁移、扩散、整合;选择缺氧缺血性脑损伤后1周时进行移植效果较好.     

人胚胎骨髓间质干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病的实验

目的:在制作新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型基础上,研究间质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病的应用前景。方法:实验于2002-09/2004-03在深圳宝安血站干细胞研究实验室内完成。实验中采用L-DMEM分离培养骨髓中间质干细胞。7窝SD1d龄新生大鼠共81只同窝随机分为4组:①正常组,不干预。②模型组:结扎左颈动脉,吸氧3h制成缺氧缺血性模型。③生理盐水组:造模后24h定位注射生理盐水8μL。④间质干细胞组:处理同生理盐水组,注射间质干细胞(1.0～2.0)×106/μL。Morris水迷宫试验评估移植后第42天大鼠学习和记忆能力;第10周麻醉状态下处死实验鼠,制作病理切片,苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测间质干细胞在脑内存活和分化情况。结果:①第1周内成活率:第7天,81只实验鼠存活42只,间质干细胞组与正常对照组大鼠存活率分别为75.0%和82.4%,差异不显著;明显高于生理盐水组(35.3%)和模型组(50.0%)(P<0.01)。②水迷宫试验显示间质干细胞组大鼠的空间识别和记忆能力明显优于生理盐水组和模型组(P<0.01);培训后第5天,间质干细胞组识别平台的平均时间为7.5s,与正常组7.0s不存在差异。③病理切片、苏木精-伊红染色和间接免疫实验结果显示:间质干细胞移植组中,进针注射部位存在大量移植细胞,并向周围迁移,皮质层、海马等部位检测到移植细胞;所植入的细胞约6%表达胶质纤维酸性蛋白,约8%表达神经元特异性烯醇化酶。结论:移植人间质干细胞组能有效修复缺氧缺血导致的神经受损,改善其功能,明显提高缺氧缺血性脑损伤大鼠1周内成活率。     

脐血干细胞移植治疗血红蛋白病

应用脐血干细胞移植能够使血红蛋白病患者重建骨髓并较少发生ＧＶＨＤ。移植适应症包括疾病晚期，符合骨髓移植标准并有ＨＬＡ相容的供体。脐血干细胞移植的主要优点是能够跨越ＨＬＡ障碍。应建立脐血库并从血红蛋白病高发群体及患者家族中收集脐血，使之成为ＨＬＡ相容或不相容性脐血干细胞移植的来原。     

香丹注射液诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

背景:选择一种高效、细胞损伤低的诱导人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的方法是其应用于临床的前提.目的:拟采用传统中药香丹注射液联合生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经细胞方向分化,并且与单纯生长因子的诱导作用进行比较.设计、时间及地点:免疫细胞化学水平的细胞观察实验,于2006-09/2008-04在潍坊医学院组织胚胎学教研室完成.材料:人脐血标本取自潍坊市妇幼保健院,香丹注射液的有效成分为丹参素.方法:采用密度梯度离心法分离人脐皿单个核细胞,贴壁法筛选出人脐血间充质干细胞,体外扩增,以免疫荧光方法检测表面抗原.分为2组进行诱导分化,香丹注射液联合生长因子诱导组采用30 g/L香丹注射液联合表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质下细胞向神经细胞方向分化,并且与单纯生长因子诱导组进行比较.主要观察指标:采用免疫细胞化学方法和免疫荧光方法检测诱导前后神经元特异性标志(神经元核抗原、β-TubulinⅢ)和神经胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:香丹注射液联合生长因子诱导法对脐血间充质干细胞损伤作用小,诱导效率高.脐血间充质干细胞经香丹沣射液诱导后出现类似神经细胞的形态改变,胞体呈椭圆形,伸出长突起.免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元核抗原和β-TubulinⅢ,而神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较少.香丹注射液联合生长因子诱导组的β-TubulinⅢ和神经元核抗原的阳性细胞率显著高于生长因子诱导组(P＜0.05),神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率明显低于生长因子诱导组(P＜0.05).结论:香丹注射液联合生长因子诱导对脐血间充质干细胞损伤作用小,诱导效率高,优于生长因子诱导法.且体外诱导后细胞丰要分化为神经元样细胞,而非星形胶质细胞.     

无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

于2005-06,2007-09在南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室拟建立一种在无血清培养条件下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的方法.所用无血清培养基血清替代物是将纯化人转铁蛋白直接溶于DMEM培养基金,再将去毒后的BSA、超声波粉碎后的胆固醇、胰岛素及过氧化氢酶直接加入DMEM培养基中稀释至所需浓度.体外分离的脐血单个核细胞以1×109 L-1接种,加入含氢化可的松、纤维连接蛋白的无血清培养基,7d后消化传代.取传至2,5,8代的脐血间充质干细胞,达60%～70%融合时以含β-巯基乙醇、丁化羟基苯甲醚的无血清培养基诱导其向神经细胞分化.结果在无血清条件下能培养扩增出大蕈脐血间充质干细胞,融合后可继续传代扩增;不表达CD34、CD13和CD45,强表达CD166、CD29、CD105.较强表达CD54,80%以上细胞处于G0G1期;脐血间充质干细胞经诱导后,能形成具有典型神经元形态的神经细胞,神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经胶质元纤维酸性蛋白均呈阳性表达.提示在自行研制的无血清培养条件下可成功诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化.     

人脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞移植用于大鼠脊髓损伤的实验研究

目的:探讨人脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤功能恢复的影响,寻找一种更适合治疗脊髓损伤的细胞源。方法:采集新鲜人脐带血和脐带,分离培养单个核细胞和MSCs。将脊髓损伤模型随机分成3组:单个核细胞移植组、MSCs移植组和低糖必需培养基(L-DMEM)培养组。采用免疫组化和免疫荧光检测细胞移植后1—4周细胞在脊髓内的存活情况和迁移情况,使用BBB行为学评分评估大鼠脊髓功能恢复情况。结果:L-DMEM培养液组在术后各时间点观察评分无明显差异,而细胞移植组脊髓功能处于逐渐恢复过程,与L-DMEM培养液比较,差异有显著性意义。单个核细胞移植组对损伤脊髓功能的修复作用较MSCs移植组显著,且差异有显著性意义。结论:与MSCs相比较,人脐血单个核细胞更适合作为治疗脊髓损伤的细胞源。     

人脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的功能评价

背景:在脊髓损伤模型的研究中,BBB评分系统和斜板试验均与脊髓损伤程度高度相关。目的:建立改进大鼠脊髓全横断模型,对比观察BBB评分和斜板试验在人脐血干细胞移植术后功能评价中的作用。设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-04/2008-07在广东省组织构建与检测重点实验室完成。材料:脐血来自健康足月产妇。实验动物为SPF级健康成年雌性SD大鼠50只,随机分为假手术对照组(n=10)、磷酸盐注射组(n=20)、脐血干细胞移植组(n=20)。方法:分离和体外培养人脐血干细胞。在显微镜下纵行剖开SD大鼠硬脊膜囊后,于硬脊膜内、蛛网膜外将超薄刀片刀尖直抵椎体骨质,将蛛网膜、脊髓、两侧壁和腹侧的硬脊膜作为一个整体完全划断,制作大鼠脊髓全横断模型,假手术对照组仅打开椎板,脐血干细胞移植组大鼠于脊髓两断端分别显微注射人脐血干细胞悬液6×109~7×109L-1,磷酸盐注射组注射等量磷酸盐缓冲液。主要观察指标:术后12周内每2周分别应用BBB评分和斜板试验进行1次后肢运动功能评价。结果:假手术对照组后肢运动功能于手术前后无显著变化。从术后第2周开始,磷酸盐注射组和脐血干细胞移植组逐渐恢复部分后肢运动功能,两组的BBB评分和斜板试验检测结果均表现出一致的增长趋势,呈线性正相关关系。从术后4周开始,BBB评分<13分的磷酸盐注射组和BBB评分≥13分的脐血干细胞移植组大鼠,在斜板试验中差异非常显著(P<0.01)。到术后第12周时,磷酸盐注射组和脐血干细胞移植组斜板试验角度和恢复程度分别为34.25°和52.94%、53.85°和83.23%,并且脐血干细胞移植组高于磷酸盐注射组(P<0.01),而同期磷酸盐注射组和脐血干细胞移植组对应的BBB评分和恢复程度仅分别为8.15和38.81%、13.90和66.19%,可见两组斜板试验角度恢复程度亦明显高于其自身对应的BBB评分结果。结论:与BBB评分系统相比,斜板试验能更敏感地反映大鼠爪的功能恢复,但不能特异性地反映爪的精细运动。而作为主观评分体系的BBB评分系统,虽然特异性很高,但容易受主观因素的影响,敏感性较低。因此,联合应用BBB评分和斜板试验能更好地反映脊髓神经功能恢复情况。     

脑缺血再灌注损伤大鼠尾静脉移植脐带间充质干细胞的安全性

背景：尾静脉移植干细胞穿过血脑屏障到达宿主脑损伤区域内的具体机制尚不明确。目的：观察尾静脉移植人脐带间充质干细胞治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的效果及安全性,并探讨其作用机制。方法：通过密度梯度离心法结合贴壁筛选法获取人脐带间充质干细胞并以BrdU标记。Sprague-Dawley大鼠以改良线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型,移植A组在造模后第7天、移植B组在造模后第14天通过尾静脉移植人脐带间充质干细胞,模型组不做处理。结果与结论：①移植后7,14,28,35,42,49,56d,2个移植组mNSS评分低于模型组（P〈0.05）。移植后7,14,28,35,42,49d,移植A组mNSS评分低于B组（P〈0.05）。模型组在造模后第35天、移植A组在第42天、移植B组在第49天时mNSS评分进入平台期。②2个移植组大鼠脑组织未见到CD11b、MPO单染阳性细胞,可见Brdu＋Nestin、Brdu＋MAP-2、Brdu＋GFAP、Brdu＋FⅧ,Brdu＋VEGF双染阳性细胞。结果表明人脐带间充质干细胞经尾静脉途径移植可以在宿主脑内存活,通过生成神经元样和神经胶质样细胞、促进新生血管形成并分泌神经营养因子等因素促进大鼠神经功能恢复,且未发现明显免疫排斥反应及异常分化细胞,具有较高的安全性。     

人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化

目的:前期实验采用药物诱导的方法将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞,将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞共同培养及移植入糖尿病大鼠体内,观察其在胰岛细胞生长的微环境及在体环境中向胰岛样细胞分化的潜能.方法:实验于2006-10/2007-09在汕头大学医学院生殖遗传实验室完成,属于广东省科技厅重点实验室.[1]实验材料:SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.对动物处置符合动物伦理学标准.脐带取自汕大附二妇产科健康足月妊娠剖宫产的胎儿,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:分离培养人脐带间充质干细胞,并采用酶消法分离大鼠胰岛细胞.将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔共同培养,在共培养的第3,7,14天采用放射免疫法检测胰岛素水平,RT-PCR方法检测PDX-1基因的表达,以单独培养的脐带间充质干细胞为对照.经尾静脉将人脐带间充质干细胞移植入糖尿病模型大鼠体内,采用半定量RT-PCR方法检测人insulin基因表达.结果:[1]共培养条件下的人脐带间充质干细胞由长梭形逐渐变圆,并聚集成团.[2]放射免疫法结果表明,共培养组人脐带间充质干细胞随葡萄糖浓度的增高而分泌的胰岛素量也增加,与对照组相比差异显著(P<0.05).[3]未经共培养诱导的人脐带间充质干细胞不表达PDX-1,共培养3d的人脐带间充质干细胞表达PDX-1,共培养7d的人脐带间充质干细胞仍表达PDX-1,共培养14d的人脐带间充质干细胞未表达PDX-1.[4]未经移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺不表达人insulin基因,而移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺在第60天时能够检测出人insulin基因.结论:人脐带间充质干细胞具有在体内外的微环境中向胰岛样细胞分化的潜能.     

人脐血间充质干细胞促进颅脑损伤大鼠修复的研究

目的 通过建立大鼠颅脑创伤模型,探讨移植人脐血间充质干细胞(MSCs)治疗颅脑损伤的可行性.方法 参考Feeney法制作大鼠颅脑损伤模型.实验分移植组、假手术组和对照组.采用盲法在移植后第1、4、12、21天分别对各组实验大鼠进行神经功能评分(NSS).荧光免疫组化观察移植MSCs 21 d后神经细胞的特异标志分子神经元核抗原(NeuN)的分布情况.结果成功培养人脐血MSCs.假手术组NSS评分在各时间点均与对照组差异有统计学意义(P<0.01),证明颅脑损伤模型建立成功.实验组大鼠NSS评分在第4、12、21天均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).荧光免疫组化结果显示,移植MSCs 21 d后,移植组的神经细胞明显多于对照组.结论 在成功建立大鼠颅脑损伤模型的基础上,显示通过移植人脐血MSCs,对大鼠的颅脑损伤有明显的修复促进作用.     

经静脉移植人脐血间充质干细胞在鼠损伤脊髓的表达及神经功能修复

目的:采用Brdu免疫组化标记技术观察经静脉移植人脐血间充质干细胞进入损伤脊髓组织的表达情况,探讨其促进损伤脊髓神经功能恢复的作用。方法:实验于2003-10/2005-03在苏州大学生物技术研究所干细胞实验室完成。①选取健康成年Wistar大鼠60只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组,20只/组。脐血标本来自苏州大学附属第一医院产科,产妇及其家属均签署知情同意书。②自脐带抽取新鲜脐带血50～60mL,分离培养人脐血间充质干细胞,调整细胞浓度为5×109L-1待用。在细胞移植前48h,体外进行Brdu标记。③模型对照组、干细胞移植组大鼠采用重物压迫法建立脊髓损伤模型。麻醉后取俯卧位,于T11节段处行背后方正中切口,剥离椎旁肌,咬除T11棘突及椎板,显露4mm×5mm硬脊膜,将55g重砝码放置于硬脊膜表面1min,然后逐层缝合伤口。假手术组仅显露硬脊膜,然后缝合伤口。④造模后5d,干细胞移植组大鼠自后肢大隐静脉缓缓注入人脐血间充质干细胞悬液0.2mL～0.3mL(1×106个)。模型对照组、假手术组给予等量生理盐水。⑤分别于细胞移植后1d、1,2,3周,采用BassoBeatlieBresnahan(BBB)评分法和斜板试验法测定各组神经功能情况。于细胞移植后1,3周制作冰冻切片,检测各组脊髓组织内脐血间充质干细胞的分布情况。结果:①神经功能检测结果:脊髓损伤细胞移植后3周内,模型对照组、干细胞移植组大鼠后肢运动功能均有所恢复,但干细胞移植组恢复较快,于术后1周BBB评分和斜板试验结果即明显优于模型对照组[(10.71±6.24),(5.13±3.36)分,t=2.39,P<0.05;(51.67±5.22),(46.63±3.72)度,t=3.39,P<0.01],并维持至术后3周[(17.29±4.03),(11.25±5.01)分,t=3.89,P<0.01;(65.77±8.06),(57.05±4.61)度,t=4.07,P<0.01]。②脊髓组织中人脐血干细胞的鉴定:假手术组、模型对照组脊髓组织中未见Brdu阳性表达区。干细胞移植组于移植后1周脊髓损伤区可见大量棕褐色Brdu阳性表达的人脐血间充质干细胞存在,并持续至移植后3周,而非损伤区则始终无阳性表达。结论:Brdu对脐血间充质干细胞具有良好的标记作用,经静脉移植的人脐血间充质干细胞能够进入脊髓损伤区,并可以促进损伤脊髓神经功能的修复。