早孕期人细胞滋养层细胞的分化及分离、培养、鉴定

目的:分离正常早孕期人细胞滋养层细胞并分析其分化功能。方法:用不同的消化方法分离正常早孕期人细胞滋养层细胞,分别在体外培养24h,用相差显微镜、Giemsa染色、免疫细胞化学法、扫描电镜、Transwell分析其形态及分化功能。结果:①采用低浓度胰酶一次性消化法获得绒毛外滋养层细胞,特异表达细胞角蛋白7,不表达波形蛋白,细胞互相聚集但不聚合,具有高度增殖活性和侵袭能力;②采用高浓度胰酶、长时间连续消化法分离得到绒毛滋养层细胞,具有高度融合、分泌hCG-β的合体滋养层细胞特性;③采用低浓度胰酶连续消化法获得的细胞包含绒毛外滋养层细胞和绒毛滋养层细胞,其共性是表达细胞总角蛋白,不表达波形蛋白。结论:利用不同的分离方法可有效、经济地获得具有不同分化功能的早孕期人细胞滋养层细胞。     

绒毛外滋养细胞浸润能力的调节

细胞滋养细胞起源于胚泡的滋养外胚层，是胎盘的主要细胞。妊娠早期，细胞滋养细胞代表着一个异源细胞群，在胚泡植入子宫壁后，其沿两条途经分化，即分化为绒毛滋养细胞(VCTs)和绒毛外滋养细胞(EVTs)^[1]。。其中EVTs是具有浸润能力的滋养细胞。Aplin^[2]将其分为浸润型和非浸润型两种亚型。定位在蜕膜组织的EVTs称间质滋养细胞。     

绒毛外滋养细胞的基础知识

绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast,EVT）涉及母胎免疫和妊娠期母体常见并发症的发生与发展,在20世纪80年代就已经成为国外胎盘病理学家和生物学家研究的热点.我国此项研究起步较晚,本文主要介绍其相关的基础知识.     

不同浓度瘦素对人早孕期滋养细胞MMP9表达的影响

目前普遍认为绒毛外滋养细胞侵蚀子宫螺旋小动脉参与了子宫胎盘血液循环的建立过程。作为肥胖基因产物的瘦素（1eptin）在能量代谢平衡、造血功能方面发挥很重要的作用。近年研究证实瘦素在人类胎盘滋养细胞中有表达。体外研究亦发现人工培养的滋养细胞有合成瘦素的功能，且细胞滋养细胞经诱导转变为合体滋养细胞后，其合成和分泌瘦素的能力亦显著提高。MMP是降解蜕膜基质的重要酶类，且妊娠早期以基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP9）较为重要。蜕膜基质降解后，     

甲氧滴滴涕对人绒毛外滋养细胞侵袭能力的影响

目的:探讨甲氧滴滴涕(MXC)对绒毛外滋养细胞侵袭能力的影响。方法:用胰蛋白酶消化后再经流式细胞仪分离得到人绒毛外滋养细胞进行原代培养及鉴定。细胞分为MXC(1μmol/L,3μmol/L、5μmol/L、7μmol/L)处理组及空白对照组,培养12h、24h和48h。用侵袭小室检测每组各时间点的侵袭能力,Western blot检测各组各时间点MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1表达,RT-PCR法检测MMP-9 mRNA、MMP-2 mRNA表达。结果:MXC处理组滋养细胞侵袭能力呈时间剂量依赖型下降,MMP-9 mRNA、MMP-2 mRNA表达下降,MMP-9、MMP-2表达下降,TIMP-2、TIMP-1表达增高。MMP-2及其mRNA下降程度与MXC有时间剂量效应。结论:MXC可通过改变基质金属蛋白酶及其抑制物的比例降低绒毛外滋养细胞侵袭能力。     

人早孕期蜕膜和绒毛外滋养层细胞的免疫组织化学研究

侵入蜕膜组织的绒毛外滋养层细胞在HE染色标本上不易辨认。我们用免疫组织化学,ABC法,过氧化物-抗过氧化物酶标记蜕膜组织中的hCG与hPL阳性细胞。结果证明,子宫内膜中只要有一个绒毛外滋养层细胞存在就能被显示出来。这对提高妊娠诊断,防止残留滋养层细胞的增生与恶性病变很有意义。我们在蜕膜组织中还发现3类胎盘激素阳性细胞:hCG阳性细胞,hPL阳性细胞及hCG与hPL均为阳性的细胞。这一发现,证明了蜕膜有内分泌功能。     

人乳头状瘤病毒感染对孕妇和绒毛滋养细胞的影响

目的 探讨人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染对孕妇和绒毛滋养细胞铁影响。方法 观察６２例早、中期孕妇尖锐湿疣的病理形态特点,用ＨＰＶ６／１１－ＤＮＡ探针原位杂交法检测其绒毛、胎盘组织及其中１０例外阴、阴道、宫颈尖锐湿疣组织,并用ＨＰＶ６／１１聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法验证１０例绒毛及胎盘组织。结果 孕期尖锐湿疣病变发展快,多部位发生比例高,大体形态、组织形态典型者多。ＨＰＶ６／１１－ＤＮＡ原位杂交和ＰＣＲ     

CXCL12/CXCR4在绒毛外滋养细胞中的表达及其意义

目的:研究趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblasts,EVTs)中的表达及其在妊娠中的作用。方法:取妊娠早期绒毛,培养绒毛外滋养细胞,用免疫细胞化学技术检测其中CXCR4与CXCL12的表达;并通过体外侵袭实验,分析绒毛外滋养细胞在CXCL12作用下的侵袭能力。结果:在EVTs的胞膜和胞浆中均检测到CXCL12和CXCR4的表达;EVTs在CXCL12作用下的侵袭能力在一定范围内与CXCL12浓度呈正相关(r=0.79,P<0.01),当CXCL12浓度达到10ng/ml时最强,达到100ng/ml时则开始下降。最大趋化指数为1.71±0.14。结论:CXCL12/CXCR4受体配体系统参与绒毛外滋养细胞的侵蚀,在妊娠过程中有重要意义。     

中间型滋养细胞及其相关疾病

为帮助病理医师和临床医师了解中间型滋养细胞的性质和特征,以及它所致疾病的诊断及治疗。现将中间型滋养细胞的发生与发展过程,及4种中间型滋养细胞疾病的特征及诊断要点作一综述。     

甾体激素对绒毛外滋养细胞表达HLA-G蛋白的影响

目的:探讨甾体激素(E_2、P_4)对绒毛外滋养细胞表达HLA-G的影响。方法:将分离培养的绒毛外滋养细胞(EVT)分成E_2组、孕酮(P_4)组、E_2+P_4组和空白对照组,分别向各组EVT培养液中加入不同浓度的17β-雌二醇、孕酮及17β-雌二醇+孕酮,空白对照组则不加任何激素,48h后,流式细胞仪检测各组HLA-G蛋白的表达。结果:①单独使用E_2或P_4均能上调EVT表达HLA- G蛋白,上调作用与其浓度关系密切,与对照组相比,差异有显著性(P＜0．01);②联合应用E_2+P_4亦上调EVT表达HLA-G蛋白,1000 nmol/L的E_2+P_4组HLA-G蛋白的表达,明显高于低浓度组(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L),差异有显著性(P＜0．01);③低浓度的E_2+P_4组(1nmol/L)HLA- G蛋白的表达高于同浓度的P_4组(P＜0．05),而低于同浓度的E_2组(P＜0．001);1000nmol/L,E_2+P_4组HLA-G表达显著高于单纯的E_2、P_4组(P＜0．01)。结论:①低浓度的E_2、P_4对HLA-G调节呈拮抗作用,高浓度E_2和P_4则以协同作用调节HLA-G的表达;②HLA-G可能参与了卵巢甾体激素调节胚胎植入进程。     

早孕蜕膜组织血管内皮细胞的分离与培养

我们成功地建立了应用荆豆素-Ⅰ标记的磁珠(UEA-I-Dynabeads)分离纯化早孕蜕膜组织血管内皮细胞的新技术。荆豆素-Ⅰ型可特异性地与血管内皮细胞膜表面糖蛋白上的岩藻糖基结合,用胶原酶和胰蛋白酶消化蜕膜组织成单细胞悬液,其内皮细胞阳性率在2%左右,经UEA-I-Dynabeads 纯化后,内皮细胞纯度可达90%以上并试培养成功。实验证明此项细胞分离新技术简单、快速且有效,为进一步研究血管内皮细胞的功能与作用打下了良好的基础。     

亚洲人早孕胎盘绒毛滋养细胞株的建立及其生物学特征研究

目的:建立亚洲人早孕绒毛滋养细胞株以及其相关生物学特征的分析研究。方法:采用胰酶和胶原酶I混合消化法消化绒毛组织,通过光镜、扫描电镜、透射电镜、免疫组化和免疫荧光激光共聚焦的方法对细胞的形态、超微结构、蛋白骨架和功能指标进行特征研究。结果:大多数原代细胞在体外培养至5~7代,产生自然凋亡的现象;少数细胞生长成为永生细胞。细胞检测中角蛋白18、波形蛋白、角蛋白7、移动相关蛋白、表皮生长因子受体、滋养细胞趋化因子和胎盘碱性磷酸酶呈阳性,而人绒毛膜促性腺激素和胎盘生乳素为阴性。结论:采用胰酶和胶原酶I混合消化法可获得较纯的稳定的滋养细胞并可确定该细胞株为具有部分内分泌功能的绒毛滋养细胞株,为进一步开展宫内传播性疾病的实验研究,建立稳定的细胞模型。     

人毛细淋巴管内皮细胞的分离、培养与鉴定

目的:分离培养人皮肤毛细淋巴管内皮细胞(LECs),为进一步研究淋巴管生成在肿瘤转移扩散中的作用奠定基础.方法:采用胶原酶消化皮肤组织,血管内皮生长因子受体-3(VEG-FR-3)免疫微珠进行细胞分选,克隆柱纯化细胞.显微镜观察细胞形态及结构,免疫荧光检测细胞标志物表达.测定细胞生长曲线及VEGF-C蛋白对细胞生长的影响.结果:光镜下LECs呈卵圆形单层生长,有典型铺路石征;电镜下可见细胞核大,胞浆丰富,内有空泡,细胞器丰富;LECs标志物VEFGR-3、淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)、肾小球上皮细胞整合膜蛋白(Po-doplanin)、D2-40均为阳性表达,血管内皮细胞(BVECs)标志物VIII因子表达阴性;VEGF-C对LECs的促增殖作用明显.结论:联合使用酶消、抗体磁珠分选和细胞克隆柱纯化法,可以成功分离获得人毛细淋巴管内皮细胞.     

天花粉蛋白对体外无血清培养的人早期绒毛细胞滋养层细胞hCG，孕酮分泌的影响

本研究以体外无血清培养的人早期绒毛细胞滋养层细胞和绒毛组织培养为模型，测定了天花粉蛋白对滋养层细胞ｈＣＧ、孕酮分泌的影响，发现体外无血清培养的细胞滋养层细胞分泌的ｈＣＧ在天花粉蛋白浓度为０．１μｇ／ｍｌ即下降５０％，而后下降缓慢，８μｇ／ｍｌ以上方降为零，而绒毛组织培养在天花粉蛋白浓度为０．１μｇ／ｍｌ时ｈＣＧ下降近９０％，而后下降缓慢，至８μｇ／ｍｌ以上降到零，说明体外培养的细胞滋养层细胞中有两个群体，其中一个对天花粉蛋白敏感，另一个不敏感，尽管在形态上很难区别。孕酮的反应则不同，在细胞滋养层细胞和绒毛组织培养中，随天花粉蛋白浓度升高，孕酮分泌均缓慢下降，未出现两阶段下降过程。     

Characterisation of Hofbauer Cells in First and Second Trimester Placenta: Incidence,Phenotype, Survival in vitro and Motility

Macrophages, known as Hofbauer cells, are most abundant in placental villous stroma in the first and second trimesters. Their functions are not well defined. We have used a combination of in situ and in vitro methods to characterise these cells. Lectin histochemistry and immunohistochemistry were used to identify macrophages in situ. The lectin from Maclura pomifera (MPA) was found to mark cells bearing the CD68 antigen with optimal specificity and selectivity. MPA staining was used to show that they increase in number from mid first to mid second trimester, becoming much less abundant at term. The cells are absent from mesenchymal villi, being associated primarily with villous stroma containing the prominent interstitial channels characteristic of immature intermediate villi. A mixed stromal cell isolate was studied in monolayer culture, including the use of time-lapse microscopy. Cells from first or second trimester tissue contained a subpopulation of about 14–17% of cells that exhibited a macrophage-like morphology and expressed CD68 as well as MPA-binding glycans. These cells were short-lived in monoculture, but could persist in vitro in association with a fibroblast layer for several weeks. They could switch rapidly from a macrophage-like to a fibroblastic morphology, were highly motile and associated in clusters that rapidly formed and dissipated over periods of a few hours. These data suggest that Hofbauer cells play a role in the maturation of mesenchymal into immature intermediate-type stroma. They may be important in the excavation of stromal channels. Their prolonged viability in mixed cultures suggests a paracrine relationship with resident fibroblasts. Their location and migratory behaviour predict an ability to move rapidly around the villous stroma, perhaps within the channel system, and to make transient contacts both with other macrophages and stromal cells.     

人子宫内膜细胞的体外纯化和培养

目的:旨在建立一套子宫内膜细胞体外培养和贮存传代的方法。方法:用胶原酶消化和铜网过筛法分离子宫内膜基质细胞和上皮细胞,进行单层培养。结果:子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性,腺上皮细胞可持续培养4-6周,传代2-3次;基质细胞可持续培养5-8周,传代4-6次。结论:建立了可体外培养贮存、传代的子宫内膜细胞,为进一步对其进行抗原组分研究奠定基础。