环氧合酶-2基因敲低对足细胞相关蛋白表达的影响

目的:观察足细胞环氧合酶-2(COX-2)基因敲低对足细胞相关蛋白表达的影响。方法:以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象,分为足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染组,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平,用Western bolt检测COX-2、Nephrin、Podocin、CD2相关蛋白(CD2AP)的表达水平。结果:与足细胞正常对照组及阴性转染组相比,足细胞COX-2基因敲低组COX-2蛋白表达明显降低、细胞凋亡率明显增高,而Nephrin、Podocin、CD2AP蛋白表达则显著降低。结论:足细胞COX-2基因敲低可以导致足细胞凋亡,且足细胞Nephrin、Podocin、CD2AP蛋白的表达下调。     

HnRNPE2 decoy RNA恢复C/EBPα活性诱导32D-P210的细胞粒系分化

目的：采用核不均一核糖核蛋白E2（hnRNP E2）decoy RNA靶向阻断CCAAT增强子结合蛋白alpha（C/EBPα）基因的异常翻译,诱导小鼠白血病样32D-P210细胞株向粒系分化,并进一步探讨其分子机制.方法：电穿孔法分别将野生型和突变型hnRNP E2 decoy RNA表达质粒转染入32D-P210细胞,经G418筛选出稳定株后,RT-PCR检测C/EBPa,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）与髓过氧化物酶（MPO）基因的mRNA水平;WesternBlot检测C/EBPa,G-CSFR的蛋白表达水平;瑞氏染色观察粒细胞集落刺激因子（G-CSF）刺激前后细胞形态;流式细胞仪检测分化抗原Gr-1,CD11b的表达.结果：筛选到分别稳定表达野生型或突变型hnRNP E2 decoy RNA的TG细胞株和TGA细胞株.与未转染组32D-P210细胞相比,TG细胞株C/EBPa mRNA水平无改变,但42ku-C/EBPa蛋白、G-CSFR mRNA和MPO mRNA水平分别升高了（43.8±4.9）%,（69.1±3.2）%和（37.8±4.2）%（P〈0.05）;G-CSF刺激后,TG细胞出现中、晚幼粒细胞甚至成熟粒细胞形态学特征;同时Gr-1分化抗原的表达率上升至40.3%,未转染组32D-P210细胞的Gr-1表达率5.5%（P〈0.05）;然而CD11b在3组细胞都是高表达,没有明显的变化（P〉0.05）;以上各参数在TGA细胞株与未转染组32D-P210细胞株间均无显著性差异（P〉0.05）.结论：hnRNP E2 decoy RNA能够诱导32D-P210细胞向粒系分化,其机制可能与decoy RNA特异性阻断hnRNAE2与C/EBPα mRNA非翻译区结合,调节C/EBPα mRNA翻译,恢复42ku-C/EBPα表达,上调其下游G-CSFR和MPO等分化基因的表达有关.G-CSF可加速这一作用从而促进32D-P210细胞的分化过程.     

小鼠肾脏足细胞GPSD核心蛋白在高糖环境下表达的变化

目的通过观察高糖环境培养的肾小球足细胞裂孔隔膜（GPSD）核心蛋白nephrin、podocin和CD2AP的表达,探讨糖尿病肾病蛋白尿的发生机制。方法以RT—PCR方法检测不同浓度（5、10、20和40mmol／L）葡萄糖培养液培养小鼠足细胞24h后nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达水平。结果足细胞nephrin mRNA的表达在5mmol／L葡萄糖培养液培养24h后即显著减弱（P〈0.05）,在其它浓度葡萄糖培养液培养24h后几乎无表达（均P〈0.01）;podocin和CD2AP mRNA的表达在10mmol／L葡萄糖培养液培养24h后显著下降（P〈0．01）。但随着培养液的葡萄糖浓度增加,podocin和CD2AP mRNA的表达却逐渐上调。结论口糖环境抑制足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达,可能是糖尿病肾病蛋白尿发生、发展机制之一。     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子1α对乏氧条件下食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子（HIF）-1α对食管鳞癌EC9706细胞乏氧条件下化疗敏感性的影响及其机制。方法应用化学乏氧法[氯化钴（CoCl2）加入培养液的终浓度为75μmol／L]体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率,以及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。应用Western印迹方法检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。结果针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,有效抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。同一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均明显高于乏氧培养组（均P〈0．05）。相同药物浓度及相同的乏氧条件下RNA干扰组抑制率均明显高于未转染组及转染control siRNA组（均P〈0.05）。相同的乏氧条件下转染HIF-1α siRNA与未转染组／转染无关对照siRNA组相比,S期显著增加（P〈0．05）、G1期细胞减少（P〈0．05）。结论乏氧条件下HIF-1α诱导EC9706细胞周期停止,可能是乏氧条件下细胞耐药的机制之一。RNA干扰可逆转食管癌细胞EC9706乏氧环境中化疗耐药。     

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin分布的影响

目的 构建突变型CD2相关蛋白（CD2AP）荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化.方法 定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G＞A杂合突变,测序鉴定.利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况.结果 测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变.在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓.在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚.结论 成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体.CD2AP基因160G＞A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变.     

罗格列酮经PPARγ受体介导HL-60细胞成熟分化

目的：研究人过氧化物酶体增殖物激活受体1（PPARγ）在白血病HL-60细胞分化中的作用．方法：采用Li—pofectamine2000脂质体进行HL-60细胞质粒转染．实验分单纯HL-60细胞培养组,空载体pIRES2-EGFP转染组,10μmol／L罗格列酮干预组和10μmol／L罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组．荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达．流式细胞仪检测转染效率,并对转染细胞成熟粒．单细胞特异性标志CD11b和CD14的表达进行分析．结果：转染的HL-60细胞可见绿色荧光表达,phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染效率为55％．流式细胞仪检测结果表明,罗格列酮干预组和罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组的CD11b＋和CD14＋细胞检出率均显著高于未转染细胞组与空载体转染组（P〈0．05）,且罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染具有协同效应;而未转染细胞组与空载体转染组2种表型细胞百分率差异均无统计学意义（P〉0．05）．结论：罗格列酮可通过激活PPARγ促进HL-60细胞向粒-单细胞成熟分化,有望成为治疗白血病的候选药物．     

ABCE1基因通过RNaseL途径抑制人大细胞肺癌H460细胞凋亡

摘要：目的研究ABCEl基因表达对人大细胞肺癌H460细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。方法体外培养H460细胞,分为A组（转染ABCE1-siRNA-1组）、B组（转染ABCEl-siRNA-2组）、C组（转染空质粒组）以及D组（空白对照组）。将构建好的ABCEl的siRNA（小干扰RNA）载体转染人培养的细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,WesternBlot法检测ABCEl蛋白以及RNaseL蛋白的表达,RT—PCR法检测ABCElmRNA的表达,MTT法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果将构建好的载体成功转入了H460细胞,转染后A、B组的细胞活性降低,ABCEl的表达受到阻断俨〈0．01）,RNaseL蛋白含量明显增加（P〈0．01）,细胞的增殖能力明显降低并逐渐凋亡（P〈0．01）。结论ABCEl基因可促使人大细胞肺癌H460细胞增殖并抑制细胞凋亡,其机制是阻断了2-5A／RNaseL细胞通路。     

心肌细胞对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的：观察大鼠成体心肌细胞对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化的诱导作用。方法：应用Percoll’s密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，传2代后用流式细胞术检测其表面CD34,CD71和CD90的表达，然后用Lipofectamine2000介导pEGFP-N3转染标记MSCs。将GFP标记的MSCs与新鲜分离的成体大鼠心肌细胞分别按接触、非接触（MILLICELLTM-HA半透膜分层培养）及心肌细胞条件培养液培养。1周后应用免疫荧光检测MSCs α-actin，desmin和cTnT的表达。结果：接触培养组中可见表达GFP的MSCs细胞同时表达α-actin,desmin和cTnT，而分层培养组及条件培养组中均未见α-actin，desmin和cTnT的表达。结论：大鼠成体心肌细胞与MSCs接触培养，可能诱导MSCs分化为心肌细胞。     

蛋白激酶CK2a特异性siRNA增强喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的研究

目的探讨RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2α表达后,喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的变化。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA—hH1neo—CK2α和非特异性表达质粒psiRNA—hH1neo—cont,脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot技术检测转染后Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达。设立正常对照组、顺铂（5μg/ml）组、psiRNA—hH1neo—CK2α组和psiRNA—hH1neo—CK2α＋顺铂（5μg/ml）组,应用MTT法检测转染后Hep-2细胞对顺铂敏感性的变化。结果psiRNA—hH1neo—CK2α特异性地抑制了Hep-2细胞中蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）。顺铂组（5μg/ml）及psiRNA—hH1neo—CK2α组Hep-2细胞的增殖能力分别为正常对照组的（55．32±4．68）％和（49．68±5．33）％（P〈0．05）,但均高于二者联合组（26．12±5．51）％（P〈0．05）,转染psiRNA—hH1neo—CK2α后,Hep-2细胞对顺铂敏感性增加了2．12倍。结论RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2α表达能增加喉癌细胞Hep-2对顺铂的敏感性。     

环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响

目的观察足细胞环氧合酶-2（COX-2）基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响。方法（1）以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象：分为正常对照组、5μl的siRNA组、10μl的siRNA组、15μl的siRNA组。经诱导分化成熟,在干扰48h后用半定量RT-PCR和Westernbolt分别检测COX-2mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平。（2）以10μl的siRNA组作为研究对象,分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组,用Westernboh检测nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平。结果（1）与正常对照组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15μ1的siRNA组凋亡率明显增高。（2）lμlCOX-2siRNA转染组nephrin蛋白表达显著低于阴性转染组（P〈0．05）。（3）与阴性转染组相比,10IxlCOX-2siRNA转染组Bax蛋白表达显著上调,而Bcl-xl蛋白表达稍有下调。结论敲低COX-2的基因表达可以导致足细胞凋亡,并随着干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加;在干扰浓度为10μl时,足细胞nephrin蛋白的表达下调;BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡。     

雷公藤内酯醇保护脂多糖诱导足细胞损伤的体外研究

目的 探究雷公藤内酯醇（triptolide,TPL）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的足细胞损伤模型的保护作用。方法 以LPS诱导的足细胞损伤模型为研究对象,设立空白对照组、药物组、模型组和实验组。采用免疫荧光法观察足细胞肌动蛋白细胞骨架的形态及粘着斑蛋白Vinculin的表达,激光共聚焦显微镜采集图像;Western blot检测各组血管生成素样蛋白3（angiopoietin-like protein 3,Angptl3）、CD2-相关蛋白（CD2-associated protein,CD2AP）、Synaptopodin以及Palladin的表达。结果 TPL可以使足细胞细胞骨架排列趋于整齐,部分丝状结构完整,提高足细胞CD2AP（P<0.05）和Synaptopodin（P<0.001）、Palladin（P<0.05）及Vinculin的表达,同时可降低足细胞Angptl3的表达（P<0.05）。结论 TPL可在一定程度上保护足细胞骨架,缓解LPS造成的细胞损伤。     

VEGF-165基因修饰的MSCs诱导分化后治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

目的：探讨VEGF-165基因联合单纯骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stemcells,MSCs）治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法：1）体外分离、培养兔MSCs,纯化并鉴定兔MSCs;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后以1μgPeDNA3．1-hVEGF165：3μl阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过ELISA检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。2）测定在正常条件培养和成骨备件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。3）实验动物连续三天大剂量（40mg／kg）臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠,通过MRI和组织病理学检查,建立动物模型。4）随机分成4组,每组14只。经皮穿刺于右侧股骨头,（1）生理盐水组,（2）单纯MSCs组,（3）hVEGF165基因转染MSCs组,（4）诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组。8周后,组织病理学检查成骨和细胞成活情况。结果：1）hVEGF165基因转染的MSCs能成功分泌VEGF蛋白。2）成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）;而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。3）成功建立ANFH模型。4）组织学评分：生理盐水组1．8±0．72;单纯MSCs组8．54±0．37;hVEGF165基因转染MSCs组11．96±0．26;诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组13．7±0．43,各组间差异有显著性（P〈0．05）。诱导分化转基因干细胞组与单纯干细胞组和生理盐水组之间差异非常显著（P〈0．01）。结论：诱导分化后的hVEGF165基因转染MSCs组成骨能力更好,修复股骨头缺血性坏死的能力也是最强。     

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin 分布的影响

目的 构建突变型CD2相关蛋白(CD2AP)荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化.方法 定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G＞A杂合突变,测序鉴定.利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况.结果 测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变.在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓.在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚.结论 成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体.CD2AP基因160G＞A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变.     

HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞mTOR基因表达的抑制作用

目的探讨shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰技术对人结肠癌LoVo细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因表达的抑制作用。方法合成编码shRNA的特异性DNA序列，连接到质粒pGenesil-1，采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染LoVo细胞，G418筛选4周。根据转染质粒的不同，实验分为3组：A组（正常对照组）为未转染的正常培养LoVo细胞，B组（阴性对照组）为转染pGenesil-1空载体质粒，C组（阳性实验组）为转染质粒pGenesil-1-mTOR。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LoVo细胞mTOR基因mRNA表达，免疫印迹（Western blot）法检测mTOR蛋白表达。结果双酶切产物琼脂糖凝胶电泳显示，重组质粒pGenesil-1-mTOR和空载体质粒pGenesil-1分别切出一条410、350bp大小的片段。G418筛选的转染细胞在倒置荧光照相显微镜下可观察到绿色荧光。C组LoVo细胞mTOR基因mRNA表达水平明显低于A组（P〈0.05），表达抑制率为73．0％。C组LoVo细胞mTOR蛋白表达水平明显低于A组（P〈0．05），表达抑制率为72．5％。结论shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰可明显抑制人结肠癌LoVo细胞mTOR基因表达。     

α-干扰素对脐血来源的树突状细胞分化成熟及功能影响的体外研究

目的：在体外探讨α-干扰素（IFN-α）对人脐血来源的树突状细胞（DC）分化成熟及功能的影响。方法：取lO份脐血分离单个核细胞,常规DC诱导培养条件中加入不同剂量的IFN—α（依剂量0、100、500U／m1分为A、B、C3组）。流式细胞仪分析CD83等细胞表面标志,ELISA检测IL-12等细胞因子的表达,MTT法检测DC对同种异体T淋巴细胞的增殖能力。结亲：在常规DC诱导培养条件中加入IFN—α培养的贴壁单个核细胞,在第5天即可见B、C组细胞表面呈树突状突起．第7天B、C组诱导的细胞其DC特异性表面标志CD83、HLA—DR、CD86较A组明显升高,且随IFN-α剂量增加而增加（P〈O．05）;B、C组分泌的细胞因子IL-12、IFN-γ较A组均增高,而IL-10较A组减少（P〈O．05）;B组和C组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力显著高于A组（P〈O．05）,又以T与DC比为10：1时最明显。结论：在常规DC诱导培养基础上．再加入IFN-α能进一步促进脐血单个核细胞向具有DC典型形态及更强功能的成熟DC转化。     

CIK与树突细胞联合对肾癌细胞的杀伤研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（Dc）共同培养后CIK细胞的增殖活性、表型变化及对肾癌细胞株769一P的杀伤作用。方法采集健康人的外周血单个核细胞（PBMC）,置37℃、5％C02培养箱2h,收集非粘附细胞诱导分化成CIK,粘附细胞诱导为DC,在培养7d后DC与CIK按1：40的比例混合培养,分别在3d、6d收集细胞同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对769一P细胞的杀伤活性。结果Dc—CIK共同培养后增殖速度明显快于单纯的CIK细胞,培养第10天时单纯CIK的CD3CD8、CD;cD未双阳性率分别为（50．4±1．8）％、（20．1±5．2）％,共培养3dDC—CIK的CD;CD8＋、CD36＋未的阳性率分别为（67．2±5．2）％、（37．9±4．1）％,6dDC-CIK的CD3＋CD8、CD3CD56的阳性率分别为（75．2±3．1）％、（48．3±2．9）％,表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。在1：5—1：40靶效比范围内DC—CIK对肾癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,且随效靶比增强杀伤活性增强（P〈0．05）。结论DC—CIK的增殖活性和细胞毒活性均高于单纯CIK细胞。     

负载LMP－1基因的树突状细胞诱导CTL对鼻咽癌细胞的杀伤效应

目的：探讨超声联合微泡造影剂能否增强绿色荧光蛋白（GFP）质粒pEGFP—C3－LMP－1转染树突状细胞（Dendriticcells,DC）,进而探讨转染LMP－1基因的DC诱导细胞毒性T淋巴细胞（cTL）对鼻咽癌（NPc）细胞株的体外杀伤作用。方法：体外培养的人DC分为四组：①单纯质粒组（A组）：加入质粒;②超声照射组（B组）：质粒＋超声辐照;③微泡造影剂组（c组）;质粒＋微泡造影剂;④超声＋微泡造影剂组（D组）：质粒＋微泡造影剂＋超声辐照。荧光显微镜观察GFP质粒在DC内的表达,流式细胞仪评价GFP质粒的转染效率。另将体外培养的DC分为两组用于检测DC表面袁型的表达及体外杀伤实验：①空白对照组,单纯培养的DC;②基因转染组,具体实验方法同上述D组。流式细胞仪检测DC表面分子表型的表达。DC和T细胞混合共培养获得的CTL为效应细胞,LMP－1表达阳性的NPC细胞株C666—1为靶细胞,按效靶比10：1的比例混合培养24h后,MTT法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果：D组DC内有较多的绿色荧光表达,且转染效率最高（14．86±2．36）％,和其余各组均有显著性差异。LMP—1基因转染组DC表面标志CD80、CD83、cD86、CD40、HLA—DR的表达明显高于对照组。所诱导产生CTL对靶细胞有明显的杀伤作用,其杀伤效率为（41．72±3．53）％,明显高于空白对照组（7．62±2．36）％。结论：超声联合微泡造影剂可有效地介导GFP质粒转染DC。LMP－1基因转染组De诱导产生特异性的CTL对靶细胞有明显的杀伤作用。     

缬沙坦对小鼠足细胞GPSD核心蛋白在高糖环境下表达的影响

目的通过观察缬沙坦体外干预高糖环境培养的小鼠足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达,探讨RAS抑制剂治疗糖尿病肾病蛋白尿的机制。方法用不同浓度的缬沙坦干预高糖(25mmol/L的葡萄糖)培养24h后的小鼠足细胞,以RT-PCR方法检测干预前后足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达水平;以间接免疫荧光法检测2×10-5mol/L缬沙坦干预后nephrin、podocin蛋白的表达。结果①与对照组相比,高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达显著减弱(P<0.01);②缬沙坦能显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达(P<0.05或P<0.01);③2×10-5mol/L缬沙坦能显著上调高糖对足细胞nephrin和podocin(P<0.05)蛋白表达的抑制。结论缬沙坦显著上调髙糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达,可能是其独立于降压作用以外的降低糖尿病肾病蛋白尿的机制之一。     

活性维生素D3 对阿霉素肾病大鼠CD2AP 的影响

目的 探讨活性维生素D 类似物骨化三醇对阿霉素（ADR）肾病大鼠足细胞CD2 相关蛋白 （CD2AP）表达的影响。方法 随机法选取60 只Sprasue-Dawley 大鼠,单次尾静脉注射ADR 7.5 mg/kg 复制 ADR 肾病模型。2 周后检测24 h 尿蛋白、血清总蛋白（TP）、血浆白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、血清 肌酐（Scr）水平。将模型大鼠随机均分为模型组（ADR）、治疗组（ADR+VitD3）,另取30 只大鼠作为对照 组。于模型复制成功后2、4、6、8 和10 周检测24 h 尿蛋白。取大鼠肾组织,用Masson 染色观察肾小球的 病理损伤,透射电子显微镜观察足细胞超微结构,免疫组织化学染色和Western blotting 检测CD2AP 定位和 表达。结果 2 周后3 组24 h 尿蛋白、TP、ALB、Scr、TC 比较,差异有统计学意义（P <0.05）,提示模型复 制成功。大鼠24 h 尿蛋白随治疗周数延长而减少（P <0.05）。组织病理学结果显示,模型组肾组织大量纤维 增生,肾小管扩张和肾间质纤维化。透射电子显微镜结果显示,模型组肾足细胞结构损伤,足突广泛融合,核 畸形,脂滴聚集;治疗组较模型组有所改善。免疫组织化学染色结果显示,模型组CD2AP 表达较低,活性维 生素D3 治疗后阳性表达面积增加（P <0.05）。各组大鼠CD2AP 表达水平比较,差异有统计学意义（P <0.05）; 模型组降低,治疗组随时间延长表达增强（P <0.05）。结论 活性维生素D3 通过上调CD2AP 表达,减轻足 细胞的损伤,抑制肾组织病理纤维化增生,发挥肾保护功能,减少蛋白尿的产生。