抗人骨唾液蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人骨唾液蛋白（BSP）单克隆抗体（mAb）,并对其生物学特性进行鉴定,为BSP作为乳腺癌骨转移临床诊断靶点的研究奠定基础。方法重组BSP蛋白免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与Sp2／0细胞融合,经筛选建立可稳定分泌抗BSPmAb细胞株,制备腹腔积液,ProteinG纯化。ELISA检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定mAb的亚型。应用Western blotting检测mAb的特异性,进一步利用纯化的mAb经免疫组织化学法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中BSP的表达情况。结果获得9株抗BSPmAb细胞株,选择其中2株（D001和D002）进一步鉴定,其上清效价分别为1：5120和1：10240,腹腔积液效价分别为1：25600和1：51200。2株抗体亚型均为IgG1型,轻链均为K型。Western blotting结果均在预期位置出现阳性条带。利用此2株细胞株所得抗体均可在乳腺癌细胞MDA-MB-231中检测到BSP的表达。结论成功制备能特异性识别BSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能以及对BSP作为乳腺癌骨转移的标志物进行临床评价奠定基础。     

抗人微管不稳定蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备人微管不稳定蛋白（Stathmin）的单克隆抗体,检测Stathmin蛋白在真核细胞中的表达,为探讨Stathmin 生物学功能奠定基础。方法利用重组Stathmin蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗Stathmin单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫组织化学实验等方法分别对其效价和特异性进行鉴定。结果成功地建立了2株稳定分泌抗Stathmin的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为F001和F002。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。两株单克隆抗体通过免疫组织化学实验和Western blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的Stathmin蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗Stathmin蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Stathmin的生物学功能及其与肿瘤的关系创造了条件。     

抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶单克隆抗体的制备和鉴定

背景与目的:制备抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR]的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.材料与方法:以基因工程重组兔NRDR为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌兔NRDR mAb的细胞株.以间接ELISA法筛选阳性克隆、鉴定Ig亚类、细胞培养上清及腹水效价,同时采用Western blot方法检测mAb的特异性.结果:获得3株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(NR1、NR2和NR5).其抗体亚类均为IgG1,细胞培养上清效价依次为1∶20、1∶40和1∶20,腹水效价分别为1∶106、1∶107和1∶106.Western blot结果显示NR1、NR2和NR5抗体均能有效识别兔肝组织中的NRDR及重组表达的兔NRDR.结论:成功地建立了稳定分泌兔NRDR mAb的杂交瘤细胞株,为NRDR生物学功能的进一步研究打下了基础.     

抗膜联蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗膜联蛋白Ⅰ单克隆抗体(mAb),对其进行特性鉴定,为在恶性肿瘤诊断和治疗中的应用打下基础。方法：构建膜联蛋白Ⅰ基因480 bp的原核表达载体pQE30-ANXⅠ,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,并用Ni-NTA树脂亲和层析柱纯化蛋白。用纯化的膜联蛋白Ⅰ作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化,制备抗膜联蛋白Ⅰ蛋白的单克隆抗体。用ELISA、Western blot及免疫组织化学染色法进行特性鉴定。结果：获得5株分泌抗膜联蛋白ⅠmAb的杂交瘤细胞,分别命名为1A8、1D2、1E2、4E7和5G3,所产抗体,均为IgG1亚型,轻链均为κ链,亲和力为(2．3～3．03)×10~8 L/mol。经Western blot证实获得的mAbs可以特异性识别膜联蛋白Ⅰ抗原；免疫组织化学染色结果也显示这些mAbs可以特异识别肿瘤组织中的膜联蛋白Ⅰ。结论：成功地获得了5株抗膜联蛋白Ⅰ的mAbs,为进一步在肿瘤诊断和治疗中应用膜联蛋白Ⅰ抗体打下了基础。     

死亡受体5在肝癌细胞系及肝细胞系表面的表达

目的：利用抗死亡受体5（Death Receptor5）单克隆抗体（mAb），检测DR5在肝癌细胞系的表达。方法：sDR5免疫BALB／c小鼠，小鼠脾细胞与SP2／0-Ag14细胞在50％PEG条件下融合，获得能够分泌抗DR5单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用杂交瘤细胞株分泌的抗DR5特异性单克隆抗体，采用流式细胞仪枝术测定抗DR5 mAb结合至细胞表面的量来分析死亡受体DR5在肝癌细胞系及肝细胞袁面的表达情况。结果：不同细胞表面DR5的表达水平分别为：人肝癌sMMC7721细胞95％、人肝细胞癌HepG2细胞40％，人正常肝细胞HL-770220．3％。结论：抗DR5mAb能够特异性与DR5结合。DR5在人肝癌sMMC7721细胞高水平表达，人肝细胞癌HepG2细胞中度表达，人正常肝细胞HL-7702细胞低表述。谅特异性mAb在研究TRAIL受体的生物功能上是一种有用的工具，对研究DR5在组织和细胞系表达十分有价值。     

人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备

目的克隆表达重组人生存素,制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法用RT-PCR方法从培养的人白血病细胞株HL-60中克隆人生存素cDNA,克隆到原核表达载体pET32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,目的蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价,Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性。结果所克隆生存素cDNA序列与Genbank中序列完全一致,将其读码框插入原核表达载体pET32a(+)诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白,表达量占总菌体的30%,纯化后融合蛋白的纯度为95%,所制备的鼠抗血清的效价达1:1600,Western blotting证实其有较好的特异性,可以检测肿瘤细胞生存素的表达。结论我们已克隆并表达了人生存素基因,所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测。     

抗上皮细胞黏附分子单克隆抗体的制备及应用

 目的　制备抗人类上皮细胞黏附分子（EpCAM）的单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定及初步功能研究。方法　将原核表达的EpCAM免疫BALB／c小鼠,按常规方法将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2／0细胞进行融合,用酶联免疫吸附试验进行阳性克隆的筛选。免疫印迹法对制备的mAb进行鉴定,用免疫组织化学法对临床的3份大肠癌组织样本进行初步检测。结果　酶联免疫吸附试验筛选获得了3株分泌抗EpCAM的mAb杂交瘤细胞株1B10、3G2和4E11。免疫印迹检测结果表明,3株杂交瘤细胞株分泌的抗体均能与EpCAM呈阳性反应,与GST蛋白不发生反应。免疫酶组织化学染色结果显示3株mAb能使3份大肠肿瘤组织样本呈现阳性反应,效果优于对照mAb。结论　成功地制备了3株识别大肠癌细胞表面抗原的mAb,这些mAb在大肠癌的诊断中可能具有一定潜在的应用价值。     

人白介素24单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗白细胞介素24（Interleukin 24,IL-24）的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：应用分子生物学技术,构建含人IL-24编码序列的原核表达载体,表达并纯化了人IL-24融合蛋白。用纯化人IL-24融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,采用免疫印迹及免疫组化染色对抗体的特异性进行了鉴定。结果：获得3株能稳定分泌抗IL-24单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G2,3F4,4A6。通过免疫印迹及免疫组化染色检测显示,这3株单抗均能够与IL-24特异性结合。结论：成功制备抗IL-24单克隆抗体,为进一步探索IL-24在抗肿瘤中的作用机制奠定了基础。     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N1乙酰基转移酶(SSAT)的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备.方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆茵细胞.SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化.用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测.结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆茵中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高.结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体.     

分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

采用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤SP_2/O细胞与用人甲胎蛋白抗原免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合,经多次筛选,获得7株分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其培养液上清和腹水效价分别为10~(-2)和10~(-6～9-)。杂交瘤腹水经硫酸铵盐析,DEAE纤维素层析,或免疫吸附亲和层析法纯化,每ml腹水单克隆抗体的产量为1～2mg。用ELISA,免疫双扩散、聚丙烯酰胺凝胶电泳、间接免疫荧光法鉴定了单克隆抗体的特异性、亲和力、稳定性及IgG亚类。     

抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备及应用

目的:制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(Tg)单克隆抗体的杂交瘤,建立检测Tg的ELISA方法。方法:以人甲状腺球蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备分泌抗人TgmAb,并对其进行特异性鉴定,建立双抗体ELISA夹心法检测Tg。结果:共获得7株可稳定分泌抗人TgmAb的杂交瘤细胞株FMU-TG1～FMU-TG7,用单抗FMU-TG和Tg多克隆抗体建立了检测人Tg夹心ELISA试剂盒,敏感性可达30ng/ml,结论:成功制备了抗人TgmAb并建立了检测人Tg夹心ELISA试剂盒,对Tg的基础研究及临床应用具有重要意义。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶18单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶18（Dusp18）单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp18功能的研究奠定基础。方法重组Dusp18免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与SP2／0细胞融合,经筛选建立可稳定分泌抗Dusp18的单抗细胞株,制备腹腔积液,ProteinG纯化所得腹腔积液,ELISA及Westernblotting检测抗体的效价和亲和力,用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。应用免疫组织化学检测Dusp18在肝癌组织中的表达情况。结果获得两株（F003和F004）单抗,上清效价分别为1：5120和1：10240,腹腔积液效价分别为1：25600和1：51200,Westernblotting结果均在预期位置出现阳性条带。利用两株抗体均可在肝癌组织中检测到Dusp18的表达。两株抗体亚型均为IgG1型,轻链均为k型。结论成功制备能特异性识别Dusp18的单克隆抗体,为进一步研究Dusp1的生物学功能,揭示其与肿瘤发生、发展之间的关系奠定了基础。     

人白介素24单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗白细胞介素24(Interleukin 24,IL-24)的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:应用分子生物学技术,构建含人IL-24编码序列的原核表达载体,表达并纯化了人IL-24融合蛋白。用纯化人IL-24融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,采用免疫印迹及免疫组化染色对抗体的特异性进行了鉴定。结果:获得3株能稳定分泌抗IL-24单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G2,3F4,4A6。通过免疫印迹及免疫组化染色检测显示,这3株单抗均能够与IL-24特异性结合。结论:成功制备抗IL-24单克隆抗体,为进一步探索IL-24在抗肿瘤中的作用机制奠定了基础。     

抗p53融合蛋白单克隆抗体的性质鉴定

目的 :研制出能特异与p5 3结合的单克隆抗体 ,使对 p5 3的检测得到更为广泛的应用。 方法 :以原核表达的 p5 3-GST融合蛋白为免疫原 ,常规方法作细胞融合 ,间接酶联免疫吸附试验 (ELISA)双筛和免疫组织化学(IHC)筛选 ,将能稳定分泌抗人p5 3单抗的杂交瘤细胞株的细胞上清 (命名为M12 6 )与常用p5 3进口单抗PAB180 1(ZYMED公司 )作对比实验。结果 :此单抗适用于ELISA、IHC、免疫印迹及免疫沉淀等方面的研究 ,并且在一定程度上优于PAB180 1。结论 :新制备的单抗M12 6可考虑取代进口单抗PAB180 1而用于p5 3的表达及突变研究。     

The studies on monoclonal antibody SZ-39 against human glioma cells

A hybridoma cell line SZ-39 secreting monoclonal antibody against the human glioma cell has been established by a fusion between NS-1 myeloma cells and spleen cells from mice immunized with human glioma cell lines. Monoclonal antibody (McAb) SZ-39 was analyzed by ELISA, quantitative absorption, indirect immunofluorescence and ABC immunohistology. McAb SZ-39 strongly bound to 9/10 glioma cell lines, 17/20 glioma tissues, weakly bound to one liver cancer cell line and 1/2 lung cancer line, but they did not band with other tested human cancer linse. NcAb SZ-39 have no crossreaction with lymphocyte, ABC red blood cells, white blood cells, blood platelet normal bone marrow cells, fibroblast cells and 12 normal human tissues. The result indicated the antigen recognized by McAb SZ-39 may be a glioma-associated antigen (GAA). This GAA was analyzed by means of Western blotting. It was a MW 180 Kd glycoprotein. The¹³¹I-McAb SZ-39 specifically localized in human glioma xenografted in nude mice that indicate it may be useful in radioimmunoimaging and as a target for immunotherapy on human glioma.