CRISPR/Cas9系统在现代生物学研究和临床试验中的应用

 规律成簇间隔短回文重复结构(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protien 9,Cas9)系统在生物医学研究中被广泛应用于基因编辑及探索基因的功能。这种基因编辑技术越来越多地运用在人类疾病的治疗中,包括巴斯综合征、杜氏肌萎缩症、血友病、地中海贫血和囊性纤维化。CRISPR/Cas 9基因编辑系统可以在体外细胞实验和体内动物实验上修复突变的DNA序列,也能改变 CCR5、PD-1/L1、CAR-T等基因序列,用于控制 HIV病毒的入侵及提高肿瘤免疫治疗的疗效。该技术还被运用于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)分化,形成某些具有功能的器官用于器官移植。本文综述了CRISPR/Cas 9系统的来源、结构和作用原理,以及其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用。     

疾病模型构建新时代——CRISPR/Cas基因编辑技术

在医学研究中,根据疾病构建模型一直是极其重要的.模型的构建对研究疾病的发生与治疗有着极为重要的意义.随着科学技术的发展,对在疾病模型构建中所应用的基因编辑技术的要求不断提高,CRISPR/Cas基因编辑技术应运而生.CRISPR/Cas是存在于细菌和古细菌中的一种免疫机制,通过人工改造CRISPR/Cas,可以使其成为一种新的基因编辑技术.相较于传统编辑方法,CRISPR/Cas系统更简单高效,易于操作,构建疾病模型成本低、耗时短,因此成为当今广泛研究和应用的方法.就CRISPR/Cas系统的基本构成、作用原理、技术方法与当前应用进行综述,并对该技术的前景进行展望,希望对有关领域的研究者有所帮助.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤耐药研究中的应用进展

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统.与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9操作更加简便、高效.目前,该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用,包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面.CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题,但其应用前景非常广阔.本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述.     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术生成靶向识别Her2的B细胞免疫治疗研究

目的 利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用。方法 设计针对B细胞抗原受体（BCR）的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验验证sgRNA的切割效率。通过分子克隆技术从曲妥珠单抗基因中调取scFv序列并和同源臂连接在一起,构建到cppt-IRES-GFP慢病毒载体中作为同源重组模板。分别将Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒与BaEVTR包膜质粒、psPAX2-D64V骨架质粒包装成整合酶缺陷的慢病毒（IDLV）,用2种慢病毒同时感染人原代B细胞进行基因编辑。将基因编辑的B细胞与Her2阳性肿瘤细胞SKBR-3共培养,通过流式检测B细胞的活化和增殖。用293T-CD40L-sBAFF饲养细胞扩增基因编辑的B细胞。从临床生物样本库获取Her2阳性乳腺癌标本构建患者来源的肿瘤类器官模型,评估基因编辑B细胞浸润、清除肿瘤的能力。结果 选择IGHD作为打靶位点、切割率最高的sgRNA（约为52%）作为最终的打靶序列...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术:基因剪刀—重写生命密码的工具——2020年诺贝尔化学奖简介

2020年诺贝尔化学奖授予了Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A. Doudna博士,以表彰她们在“发展了基因组编辑技术”方面做出的贡献。本文对CRISPR/Cas9结构、原理进行了系统介绍,简要回顾了CRISPR/Cas9技术的发现及发展过程,最后对CRISPR/Cas9技术面对的前景、挑战与争议进行了展望。     

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌转移中的研究进展

由成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其相关蛋白9(CRISPR associated nuclease,Cas9)介导的基因编辑技术已被广泛用于探究癌症相关基因的功能、建立癌症动物模型和探测物药靶点,是一种高效、快速和位点特异性的工具。近年来,卵巢癌发病率逐年增加,严重威胁女性健康。目前多采用手术、放疗、化疗或联合治疗等方法延缓疾病的进展,但效果不佳,是临床迫切需要解决的一大问题。因此,利用CRISPR/Cas9技术靶向致病基因、筛选相关功能基因及寻找新的药物靶点为卵巢癌的治疗带来了希望。本研究对既往CRISPR/Cas9技术在卵巢癌转移中的研究应用进行综述,希望对该领域未来的研究奠定理论基础,也为肿瘤特别是卵巢癌的治疗提供新的参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤研究中的进展

恶性肿瘤是严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一.根据国家癌症中心统计数据[1 ]显示,恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23. 91％,2015年恶性肿瘤发病392. 9万人,死亡233. 8万人.随着多重基因分型和高通量基因组分析等测序技术的迅猛发展[2-3 ] ,大多数癌症基因组的遗传变异已在结构上得到鉴定,但由于...     

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型.方法 根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录.利用体外转录的gRNA/Cas9 mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定.结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9 mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5％)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目最多的4号小鼠产生31个碱基缺失.结论 成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型.     

CRISPR/Cas9递送系统的研究现状及应用进展

针对CRISPR/Cas9系统在DNA、RNA和蛋白3种水平的递送形式,本文着重介绍了CRISPR/Cas9系统的病毒载体和非病毒载体的研究现状和CRISPR/Cas9系统递送的新策略,及其在生物医学领域和基因相关疾病治疗的应用进展。通过对CRISPR/Cas9系统递送和基因治疗策略进行总结与阐述,为创新药物的发现和基因治疗的开发提供新思路。     

CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索

目的探索利用CRISPR/Cas9技术在细胞株Hep G2基因组中进行定点突变。方法设计并构建靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的g RNA质粒。将构建好的g RNA质粒和h Cas9质粒转染Hep G2细胞后,PCR扩增Hep G2基因组中LRH-1和ERRα基因的突变位点,并用SURVEYOR法检测突变情况。结果靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的g RNA质粒构建成功。Hep G2细胞经g RNA-LRH-1/g RNA-ERRα和h Cas9转染后,针对LRH-1和ERRα的突变位点基因组序列的PCR产物经SURVEYOR法检测结果显示出现两条与预计大小相符的电泳条带。结论在Hep G2细胞中成功利用CRISPR/Cas9技术介导的基因组编辑对LRH-1和ERRα特定基因组序列产生突变,为构建其细胞株敲除模型奠定了基础。     

利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株

目的:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因,构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法:设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA,以PX462质粒为载体,构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果:sgRNA正确插入到PX462质粒载体中,转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论:成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。     

CRISPR/Cas9构建TGFBI稳定敲除HSC-3细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）细胞系HSC-3中的TGFBI基因。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA（small guide RNA, sgRNA）,并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒。将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除。免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达。同时,通过RT-qPCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变（P＜0.05）。结论通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA 21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48 h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA 21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150 V,脉冲时间5 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的 利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2（YY1 associated factor 2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法 首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒pX335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞,7天后,再用另一对转染HeLa细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果 成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论 利用CRISPR/Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因,为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。