HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的：扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础。方法：利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达。结果：从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41％的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达。结论：利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达。     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达

目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体, 建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因, 将WDR5插入pCI-neo载体中, 酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞, Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后, 用G418筛选获得稳定表达的细胞株, Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达, 为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.     

p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立

目的　构建pCR○R3 1 p16真核表达质粒 ,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株。方法　将人的p16cDNA亚克隆至pCR○R3 1,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌 ,筛选阳性克隆 ,进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及DNA测序 ,将已鉴定的pCR○R3 1 p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中。结果　重组质粒双酶切后 ,出现约 80 0bp片段 ,提示p16cDNA片断已插入pCR○R3 1多克隆位点内 ,DNA测序显示p16cDNA按照正确方向和阅读框插入表达载体pCR○R3 1。通过pCR○R3 1 p16转染NIH3T3细胞 ,获得 10个G4 18抗性克隆 ,其中 2个为RT PCR阳性。结论　成功构建pCR○R3 1 p16真核表达载体并建立了其稳定表达的NIH3T3细胞株。为建立p16转基因鼠奠定基础。     

人HSP 70真核载体的构建及其在胆囊癌细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70,并在胆囊癌细胞SGC996中进行表达。方法构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70,经EcoRⅠ及BarnHⅡ双酶切鉴定并测序;通过脂质体法转染SGC996胆囊癌细胞,经G418抗性筛选获得稳定表达细胞株;用流式细胞术检测其表达情况。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;体外转染入SGC996细胞中后,可见转染细胞有Hsp70蛋白的表达。结论成功构建了pcDNA3．0-Hsp70真核表达载体,为研究Hsp70在肿瘤免治疗中的作用奠定了基础。     

小鼠PD-L1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的构建含有小鼠PD-L1基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达小鼠PD-L1分子的CHO细胞系。方法从小鼠脾细胞总RNA逆转录的cDNA中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（XhoI和EcoRI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选后,建立稳定高表达PD-L1分子的CHO细胞系。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP／PD-L1,建立了稳定表达PD-L1目的基因的CHO细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定表达该分子的CHO细胞系为后续研究奠定了物质基础。     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

钙整合素结合蛋白CIB真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建钙整合素结合蛋白(calcium- and integrin-binding protein, CIB)的真核表达载体,了解它在真核细胞中的表达及定位.方法 从人脑组织分离总RNA,采用RT-PCR获得CIB开放读框序列,克隆至真核表达载体pCMV-myc,构建表达带myc表达标签的真核表达载体pCMV-myc-CIB,将其转染至NIH3T3细胞中,免疫组化鉴定其在细胞中的表达及定位.结果 序列分析表明克隆的CIB序列与GeneBank报道的序列一致,脂质体转染入NIH3T3细胞中,用myc抗体检测到目的蛋白myc-CIB的表达.结论 pCMV-myc-CIB表达载体构建成功,并在真核细胞中得到了正确表达,CIB蛋白主要定位于细胞质中.     

构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞

目的：构建人补体衰变加速因子（DAF）真核表达载体pSecTag2／HygroB-DAF，并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NH／3T3成纤维细胞。方法：应用PCR方法，从DAF—pGEM—T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB—DAF真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH／3T3细胞，并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果：DAF基因大小为1049bp，与基因序列数据库中记载的人DAF cDNA序列结果完全一致；利用壳聚糖-DAF纳米微粒转染NIH／3T3细胞24h后，免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论：成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NH／3T3细胞。     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响。结果:成功构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-HsPDF。该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达。HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征。结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础。     

Survivin反义核酸真核表达载体的构建及在胶质瘤细胞中的表达

目的构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并检测其在恶性胶质瘤细胞SHG-44中的表达。方法构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并用脂质体介导转染入SHG-44细胞,通过RT-PCR及western blot检测细胞中survivin mRNA和蛋白的表达。结果构建了survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SWas,并成功导入SHG-44细胞中,且有效表达,使SHG-44细胞中survivin mRNA和蛋白表达水平均降低。结论Survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-sVVas可以降低SHG-44细胞survivin基因的表达。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.