基于链置换反应的DNA等温扩增技术应用进展

DNA等温扩增是在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的一种扩增技术。链置换反应指某些具有链置换活性的DNA聚合酶在延伸新链的同时将下游旧链剥离,它已被用于多种体外等温扩增技术,包括链置换扩增、滚环扩增、多重置换扩增、环介导的等温扩增等。其主要应用于DNA测序、全基因组扩增、基因芯片、微生物病原体检测等领域。     

microRNA定量检测方法研究现状

MicroRNA(miRNA)是一类由18～24 nt核酸构成的非编码内源性小分子RNA,主要参与真核生物的细胞分化、增殖与凋亡等转录后水平的基因表达调控.研究发现,miRNA与肿瘤、代谢调控、疾病发生及诊断等方面有密切的联系,因此准确且灵敏地进行miRNA的定量检测是深入研究miRNA功能的前提.目前,miRNA定量检测原理主要基于核酸杂交或扩增,包括Northern印迹、微阵列芯片、实时定量PCR、滚环扩增等.本文通过对传统miRNA检测方法、高灵敏度新型miRNA检测方法进行阐述与分析,为筛选合适的miRNA定量检测方法提供参考.     

一种高效扩增小片段DNA方法的建立

目的建立一种高效扩增小片段DNA的方法。方法 本方法利用单链DNA连接酶(single strand DNA ligase,ssDNA ligase)可以连接单链DNA的性质将小片段DNA自连成环,随后利用phi29DNA聚合酶进行恒温的滚环复制,将扩增产物进行酶切,得到了扩增后的小片段DNA。结果 单链DNA连接酶可以有效的将30bp的小片段DNA自连成环,phi29DNA聚合酶可以扩增出大于10kb的DNA片段,扩增产物经酶切后又可进行第二轮扩增,并且证明了其成环方式为自成环。结论 通过单链成环后滚环复制的这种方法可以有效的将小片段DNA进行扩增,解决了PCR无法扩增小片段DNA的问题,并有着广阔的应用前景。     

几种主流恒温扩增技术及其优化策略进展

2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-n CoV)疫情严重威胁着人类健康与经济发展,遏制疫情发展的关键是如何准确、快速地完成2019-nCoV病毒检定。虽然2019-n CoV检测主流技术平台为PCR聚合酶链反应,但恒温扩增技术因其无需昂贵设备、操作流程简便、即时检验、结果判读简易可视化等优势,逐步成为某些紧急场景PCR替代技术。本文综述了六种主流恒温扩增技术,即依赖核酸序列扩增、滚环核酸扩增、链置换扩增、解旋酶依赖扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导恒温扩增,并从等温核酸扩增原理、优化反应策略及其应用领域进行了阐述。     

表面等离子共振技术结合滚环扩增法检测丙型肝炎病毒

目的研究滚环扩增(RCA)技术结合特异性表面等离子共振(SPR)金膜芯片检测丙型肝炎病毒(HCV)的方法。方法根据丙型肝炎x-tail区域的特异检测序列,设计并合成针对RCA法检测HCV的探针和引物,分成3组(实验组、阴性样品组和阳性样品组)进行RCA实验,验证RCA法检测HCV的特异性。将模板浓度按10倍梯度稀释,评价SPR技术结合RCA法检测的检测限。在普通金膜芯片的基础上进行表面化学处理,形成高特异性核酸芯片,用抗蛋白实验验证芯片抗蛋白能力。采用双通道SPR仪对RCA反应及信号放大反应进行实时观测。运用SPR技术结合RCA法检测63例临床血液样品,并与Real-Time PCR法比较,评价其灵敏度和特异度。结果 SPR技术结合RCA法对HCV阳性标准品的最低检测浓度为1 pmol/L,低于Real-TimePCR法的检测限(0.1 nmol/L)。SPR芯片具备良好的抗蛋白质非特异性吸附能力。双通道SPR仪对RCA芯片系统的检测信噪比为100,实现了对HCV的检测。对临床样品的检测灵敏度为90.0%(27/30),特异度为84.8%(28/33)(χ2=8.10,P=0.004)。结论 SPR技术结合RCA法将生物传感技术及原位扩增技术相结合,实现了快速、非标记和实时检测HCV。     

双循环线性滚环扩增检测HBV替诺福韦耐药位点的方法学研究

目的探讨双循环线性滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的可行性。方法以HBV替诺福韦耐药基因突变位点为检测靶点,设计该位点的锁式探针以及包括该位点的HBV野生型、突变性模板。锁式探针与野生型模板特异识别并结合,通过E.coli连接酶连接为闭合环形结构,加入引物启动第1轮RCA;扩增产物用HpaⅠ酶切游离出检测模板,重复上述过程进行第2轮RCA,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;并对该方法的特异性、检测限及连接效率的影响因素进行初步探讨。结果探针与模板的杂交温度为45℃时,探针的环化连接效率最高、特异性最好。通过对不同浓度野生型模板的检测,单循环RCA的检测限为50pmol/L,双循环RCA的检测限为5pmol/L,检测灵敏度提高了10倍。结论初步建立了检测HBV替诺福韦基因耐药位点突变的双循环RCA方法。     

应用滚环扩增研究肝癌组织中的HBV cccDNA

目的：运用滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）分离肝癌患者组织中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,研究pre-S区的缺失。方法：对RCA技术的特异性和灵敏度进行了研究,并应用该技术扩增13对癌组织和癌旁组织中HBV cccDNA,对pre-S区的缺失进行了研究。结果：RCA能够高效,特异的扩增组织中10拷贝/μl HBV cccDNA;26例样本中,22例样本的HBV cccDNA能够被RCA撤增测序,其中有8例样本（8/22,36.4%）在pre-S区域存在着缺失,pre-S2缺失比例高于 pre-S1（8/8 vs. 2/8,P=0.007）。结论：首次发现肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中HBV cccDNA存在着pre-S区的缺失,有助于深入理解cccDNA pre-S区缺失与HCC的关系。     

新型原位PCR技术在HBVcccDNA检测中的应用

目的 通过利用环扩增方法检测在HBVcccDNA肝组织中的表达,明确HBVcccDNA在肝组织中的分布状况,为进一步研究HBVcccDNA在乙型肝炎的致病机制及探讨乙肝治疗的新途径提供分子病理学基础.方法 采用PSAD酶消化、滚环扩增方法及使用根据HBVcccDNA与HBVrcDNA结构上的差异而设计的地高辛标记的原位跨缺口引物进行原位PCR,然后用免疫组织化学方法进行显色,显微镜下观察HBVcccDNA在肝组织中表达分布,并对结果进行评价分析.结论 滚环扩增方法用来检测肝组织中HBVcccDNA的表达,具有敏感性高、特异性强的特点,对研究乙型肝炎致病机制和评价抗病毒药物的疗效及新药的研发等方面其有重要的意义.     

RCA技术检测甲型H1N1流感病毒耐药基因单碱基突变的应用研究

目的建立一种检测甲型H1N1流感病毒耐药基因单碱基突变的滚环扩增技术(rolling cycle amplification,RCA)。方法以甲型H1N1流感病毒耐药基因M2基因和NA基因为研究对象,设计检测该基因突变位点的环化探针,环化探针通过与发生单碱基突变的基因特异性结合并被连接成闭合环状,进行滚环扩增后从而特异性地检测单碱基突变。讨论用于该检测的RCA技术的合适反应条件,通过对人工合成的野生型和突变型靶序列检测,确定该方法的特异性和灵敏度。最后通过对临床标本的检测及与测序结果比对,验证该方法的准确性。结果检测单碱基突变需要严格的反应条件,采用热循环连接法和提高连接温度(65℃),保证了检测特异性。通过对含有不同浓度突变靶序列标本的检测确定了该方法能检测出最低1%含量的突变株。RCA技术检测结果与测序方法结果一致。结论成功建立检测甲型H1N1流感病毒耐药基因单碱基突变的RCA技术。     

含聚多价适配体的长链DNA用于抗肿瘤药物的靶向传输

采用滚环扩增(RCA)方法合成含聚多价适配体的长链DNA(polyaptamer),并负载抗肿瘤药物多柔比星(Dox),用于靶向治疗白血病肿瘤细胞。研究结果表明,含聚多价适配体的polyaptamer载药能力比单价适配体(monoaptamer)提高了10倍以上,而其对急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的靶向效率比单价适配体提高了约35倍,极大降低了Dox对正常体细胞的不良反应。药物释放实验和肿瘤细胞杀灭实验同时证明,在酶的作用下,polyaptamer/Dox复合物进入肿瘤细胞后能够短时间内释放出Dox,从而高效地杀灭肿瘤细胞。     

核酸恒温扩增-免疫层析技术在布鲁菌病诊断中的应用

目的：探讨核酸恒温扩增-免疫层析检测方法对布鲁菌病（布病）诊断的应用价值,为核酸检测标准化推广应用提供实验室参考依据。方法：分别以全血和血清为样本提取布鲁菌核酸,应用恒温扩增技术进行核酸扩增,以免疫层析检测装置直接判读核酸扩增结果;免疫学检测应用试管凝集试验（SAT）;数据处理应用配对校正χ2检验。结果： 29例就诊者全血核酸扩增阳性率为55.2%,血清核酸扩增阳性率为23.1%,二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）;以全血为核酸提取样本,190例不同病程SAT诊断为阳性和阴性的就诊者核酸检测结果与SAT检测结果符合率为57.9%;93例首诊SAT诊断为阳性和阴性的急性早期就诊者核酸
检测结果与SAT检测结果符合率为63.4%。结论：核酸恒温扩增-免疫层析检测方法作为一项实验室辅助诊断和治疗的参考依据,对急性早期的布病患者具有较高的临床应用价值,在鉴别诊断布病患者和非患者方面无参考价值。     

环介导等温扩增技术在诊断结核病中的研究进展

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是利用两对特殊设计的引物和链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下对目的片段进行特异、高效扩增的技术。LAMP技术具有简单、快速、特异、灵敏、经济等优点,因此在结核分枝杆菌的现场快速检测和基层应用中具有广阔前景。基于此,本文主要阐述了LAMP 技术的基本原理和特点、诊断结核病的主要分子标志物,以及利用不同的分子标志物和各种类型的新型技术在诊断肺结核、肺外结核、耐药性结核病中的应用。LAMP 技术在诊断结核病中已经得到了广泛的应用,且具有较高的灵敏性和特异性,但该技术仍存在部分缺陷。本文综述了近年来LAMP 技术在结核病中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为结核病的快速诊断提供合理的研究方向。     

实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

目的采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在临床淋球菌检测中的应用。方法以淋球菌培养法为标准对照,采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测,对结果进行统计学分析比较,并用PCR法进行验证。结果使用SAT检测的生殖道拭子和尿液阳性检出均为110例,培养法阳性检出为108例,其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义(P0.05);以培养法为金标准,SAT检测拭子的敏感度为100.0%,特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%,特异度为95.2%。结论采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比,阳性率高,敏感度较高,且尿道标本收集方法比较简便,患者依从性好,可代替拭子道取样方法,此方法可在临床推广应用。     

应用连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA

目的 建立检测沙眼农原体感染的具有高度敏感性和特异性的缺口—连接酶链反应—酶联免疫吸附测定法。方法 根据CT主要外膜蛋白稳定区设计2对互补探针并分别对其两端标记生物素和地高辛，对6种CT标准株、鹦鹉热衣原体标准株和其他细菌进行Gap—LCR反应并以ELISA和EB染色电泳检测扩增产物以比较两者的检测限度。结果Gap LCR可检出6种CT标准株并不与其他细菌发生交叉反应，ELISA可检出10fg DNA模板的扩增产物，较EB电泳法敏感10倍。结论 Gap—LCR—ELISA是一高度敏感特异的检测CT感染的核酸扩增技术，是适宜于我国广大医疗基层单位进行大规模CT分子流行病学研究的极具前景的方法。     

等温扩增技术在疟原虫及巴贝虫检测中的应用

近年来,等温扩增技术（isothermal amplification technology）凭借恒温条件下对核酸高效率扩增的优势在病原体检测领域展现出了巨大的潜力。疟疾与巴贝虫病作为两类严重危害人类健康的寄生虫病在临床表现与诊断方式上相似,存在误诊的风险。同时,这两类寄生虫病可通过血液传播。因此,高效、快速的检测技术对疟疾与巴贝虫病的诊断和保证血液制品安全有重要的意义。本文对现有针对疟原虫与巴贝虫的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）、重组酶介导等温扩增技术（recombinase-aided amplification,RAA）以及依赖解旋酶等温扩增技术(helicase-dependent amplification, HDA)等四类等温扩增技术的原理、特点及检测方式进行综述并对其应用前景进行展望。     

重组酶聚合酶扩增技术在寄生虫快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）是一种新型核酸等温扩增技术,具有特异性强、灵敏度高、恒温反应、操作简单和耗时短等优点。该技术自2006年面世以来,被逐渐应用于医学、食品安全、公共卫生和农业生产等领域。寄生虫病不仅会影响人畜健康,还阻碍经济发展,带来严重的社会问题。对寄生虫病实现准确而快速的诊断有助于推进该类疾病的治疗进程,最大程度降低危害。本文综述了RPA技术的反应原理、反应条件以及在寄生虫快速检测方面的应用,分析RPA技术在原虫、吸虫和线虫检测中的敏感性和特异性。在原虫检测方面,RPA技术较为成熟,它的灵敏度明显优于传统的检测方法。在吸虫检测方面,RPA技术的敏感性和特异性等于或优于传统的检测技术。RPA技术在线虫检测方面的灵敏度优于聚合酶链式反应。此外,本文还对该技术在寄生虫病防疫工作的应用前景进行了展望。     

新型等温扩增技术应用于疟原虫等寄生虫快速诊断的研究进展

当前常用基于PCR原理的核酸检测技术来检测疟原虫,疟原虫检测方法主要包括镜检法、抗原免疫检测法和核酸检测法等。但由于存在检测时间长、人员和设备要求高等缺点,限制了其在基层的推广应用。特别是基层普遍缺乏经验丰富的专业技术人员和高端仪器设备,此外在极端环境下快速检测大规模样品的需求等对现存疟原虫检测方法造成了挑战。近年来发展起来的等温扩增技术由于具有简便、快速、灵敏性和特异性高等优点,具有潜在的应用前景。本综述介绍了试对各类等温扩增技术的原理、特点和前景等,并在此基础上重点综述重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）与重组酶介导的等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplification assay, RAA）,并提出利用这类重组酶扩增技术,实现常见疟原虫种快速、精确诊断的可能。