MTT法检测C-FLIP反义寡核苷酸对BGC823细胞的抑制效果

目的探讨脂质体Lipofectamine2000介导下c-FLIP反义寡核苷酸对胃癌细胞系BGC823生长的抑制作用.方法 RT-PCR和Western Blot方法检测c-FLIPL/S的mRNA和蛋白的表达变化;原位末端标记法、流式细胞术检测细胞凋亡;MTT法检测细胞抑制率.结果 Western Blot可见c-FLIPL和c-FLIPS蛋白表达显著下降;反义寡核苷酸作用细胞36 h后,TUNEL检测可见明显阳性染色,流式细胞分析发现在G1峰前出现凋亡峰;MTT显示脂质体介导反义寡核苷酸可显著抑制BGC823细胞增殖.结论 c-FLIPL、c-FLIPS mRNA和蛋白在Hela、BGC823细胞中表达.脂质体介导c-FLIP反义寡核苷酸转染BGC823细胞后抑制目的蛋白表达,抑制细胞生长、促进凋亡,其作用呈剂量依赖性.研究靶向c-FLIP的反义基因治疗药物可能为胃癌的临床治疗提供新的方法和思路.     

脂质体介导FLICE抑制蛋白反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡

背景与目的:FLICE抑制蛋白基因在凋亡信号传递中发挥重要作用,研究靶向cFLIP的反义基因治疗药物可能为临床治疗胃癌提供新的方法和思路.本研究拟探讨cFLIP反义寡核苷酸对人胃癌细胞株BGC823凋亡的影响.方法:以脂质体Lipofectame2000为载体,介导cFLIP反义寡核苷酸片段导入胃癌细胞株BGC823.RT-PCR和Western blot方法检测cFLIPL/s mRNA和蛋白在HeLa、BGC823细胞中的表达;以cFLIP基因翻译起始区为靶点,人工合成20个碱基全硫代修饰的反义寡核苷酸,脂质体介导转染BGC823细胞后,MTT法检测细胞抑制率;原位末端标记、流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测蛋白表达变化.结果:cFLIP mRNA的2种拼接体和表达蛋白在HeLa、BGC823细胞中呈阳性表达.MTT显示脂质体介导反义寡核苷酸可显著抑制BGC823细胞增殖,其抑制作用随浓度增加而增强;TUNEL检测可见阳性染色;流式细胞仪分析发现在G1峰前出现凋亡峰;Western blot检测可见cFLIPL和cFLIPs蛋白表达显著下降.结论:cFLIPL/s mRNA和蛋白在HeLa、BGC823细胞中表达.脂质体介导反义寡核苷酸转染BGC823细胞后抑制cFLIPL/s蛋白表达,促进凋亡.     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

转染血管内皮生长因子C反义寡核苷酸对子宫颈癌Hela细胞增生和凋亡的影响

目的体外研究脂质体介导转染血管内皮生长因子C（VEGF—C）反义寡核苷酸（VEGF—C,ASODN）对子宫颈癌Hela细胞增生和凋亡的影响。方法实验组将VEGF—CASODN（优化筛选）用脂质体导人Hela细胞,设正义（SODN）和空白对照组进行比较。用荧光显微镜观察转染率,MTT比色法检测细胞增生,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化,RT—PCR、Western blotting法检测VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果经脂质体介导可成功将VEGF—C反义核酸转染至子宫颈癌Hela细胞;细胞的增生受到明显抑制,G2／M期细胞比例增多,转染作用48h时凋亡率最高,达（19．39±1．81）％;VEGF—C在mRNA和蛋白水平的表达均明显减少,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论体外转染VEGF—CASODN可在mRNA和蛋白水平下调Hela细胞VEGF—C的表达,阻滞并同步化细胞周期,抑制细胞增生,诱导细胞凋亡。     

C-myc反义寡核苷酸对结肠癌细胞SW480增殖及凋亡的影响

目的：观察脂质体介导的c—myc正反义寡核苷酸对结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响。方法：通过脂质体将c—myc反义寡核苷酸转入人结肠癌细胞SW480，western blot动态监测c—myc蛋白的表达情况，MTT法、流式细胞仪测定c—myc正反义寡核苷酸对SW480细胞增殖和凋亡的影响。结果：c—myc反义核苷酸对SW480细胞有明显的促进凋亡和抑制增殖的作用，而正义寡核苷酸没有这样的作用。结论：c—myc反义核苷酸具有明显的抗肿瘤作用，可以抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，可能成为治疗肿瘤的药物。     

Survivin反义寡核苷酸抑制EC9706细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的 观察Sunrivin反义寡核苷酸(ASODN)对人食管癌细胞系EC9706细胞增殖和凋亡的影响.方法 人工合成Survivin基因反义和正义ODN,并进行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径分别转染 EC9706 细胞;应用 RT-PCR 和 Western Blot 检测 SurvivinmRNA和蛋白表达;应用MTT法检测 Survivin ASODN 对 EC9706 细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率.结果 体外培养的 EC9706 细胞可表达较强的 Survivin mRNA 和蛋白;Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 Survivin mRNA 和蛋白表达,50μmoL/L ASODN 几乎可以完全抑制.MTT 研究结果表明,Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 EC9706 细胞增殖,50μmol/L ASODN 对细胞生长的抑制率可达78.5%,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M 期.Survivin SODN 对 Survivin mRNA 和蛋白以及 EC9706 细胞的增殖和细胞周期无明显的抑制作用.结论 脂质体介导转染 Survivin 反义寡核苷酸可抑制细胞增殖、诱导细胞G2/M 期阻滞而促进细胞凋亡.     

cFLIP反义寡核苷酸对人肺腺癌SPCA-1细胞作用的探讨

目的:研究脂质体介导的反义寡核苷酸cFLIP对人肺腺癌细胞系SPCA-1凋亡的影响,探讨反义技术选择性封闭目的基因表达进而发挥抗肿瘤作用的机制.方法:用脂质体lipofectamineTM2000将反义寡核苷酸cFLIP(Lipo-ASODN)和无义寡核苷酸cFLIP(Lipo-NASODN)片断导入人肺腺癌细胞系SPCA-1,通过MTT法分别检测细胞生长情况;应用RT-PCR检测cFLIP基因表达,并用Western Blot检测cFLIP蛋白表达,同时原位末端标记(TUNEL)和流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:MTT实验显示浓度为0.5μmol/L时Lipo-ASODN组细胞生长曲线逐渐降低,24h细胞抑制率可达71.52%,显著高于Lipo-NASODN组和Liposome对照组(P＜0.01);转染24h后LipoASODN组RT-PCR可见cFLIP基因表达量明显少于对照组(P＜0.01),Western Blot可见cFLIPS蛋白表达呈下降趋势,但cFLIPL变化不明显;TUNEL检测可见反义寡核苷酸组细胞核内出现阳性染色,流式细胞仪检测可见明显凋亡峰,且其作用呈一定的剂量依赖性.结论:反义寡核苷酸转染SPCA-1细胞后,cFLIPL/S基因与蛋白表达显著下调,表明此途径是cFLIPL/S mRNA基因片段诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一.     

反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用.方法:采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线.结果:survivin反义寡核苷酸转染后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加.结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

Livin的siRNA对胃癌细胞BGC823生长与功能影响的初步研究

目的:观察livin基因的siRNA对人胃癌细胞株BGC823生长与功能的影响.方法:构建针对livin基因siR-NA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-livin,通过脂质体介导转染至BGC823细胞,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法分别检测livin基因mRNA和蛋白表达,激酶活性检测试剂盒检测胱冬肽酶-3(Caspase-3)的活性,MTT法分别检测PBMC和BGC823细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测混合细胞培养上清中TNF-α分泌量的变化.结果:转染48 h实验组细胞livin mRNA和蛋白表达水平明显受到抑制,表达抑制率分别为64.63%和62.80%,P<0.05;Caspase-3活性增强,细胞凋亡率为22.4%,P<0.05;PBMC和BGC823细胞增殖减慢;细胞培养上清中TNF-α分泌量明显降低,P<0.05.结论:通过抑制BGC823细胞中livin的表达,Caspase-3的活性增加,从而诱导细胞凋亡率上升;livin基因表达沉默可以抑制PBMC细胞增殖,TNF-α分泌减少,提示了livin基因可能是在细胞发生癌变初期过度表达的一个凋亡抑制基因.     

VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及与细胞增殖的关系

目的:研究VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对宫颈癌细胞增殖的影响。方法:采用反义技术,脂质体介导VEGF-C反义寡核苷酸转染人宫颈癌Hela细胞。应用荧光定量RT-PCR法、间接免疫荧光标记法,检测转染后细胞内VEGF-C在mRNA、蛋白水平的变化。MTT比色法检测细胞生长的变化。结果:脂质体介导VEGF-C反义寡核苷酸,转染宫颈癌Hela细胞的转染效率大于90％。转染了反义寡核苷酸的反义组VEGF-C在mRNA和蛋白水平上,较未转染组和正义组均明显下降（P<0.05）。MTT法检测转染了VEGF-C反义寡核苷酸的细胞,明显看到反义组细胞的生长受到明显抑制。结论:VEGF-C可影响人宫颈癌Hela细胞增殖,本实验通过抑制VEGF-C,进而可阻断宫颈癌的淋巴转移,为实现靶向性基因治疗的可行性,提供了实验依据。     

细胞周期素D_1反义寡核苷酸对胃癌细胞株BGC-823的作用

目的 :通过基因反义封闭技术体外抑制细胞周期素D1 (cyclinD1 )的表达 ,并对胃癌细胞增殖的影响。方法 :以胃腺癌BGC 82 3细胞株为研究对象 ,采用硫代修饰的cyclinD1 反义寡脱氧核苷酸 (ASODN)处理BGC 82 3细胞后 ,观察cyclinD1 ASODN对BGC 82 3细胞基因表达及体外增殖活性的影响。结果 :MTT法测细胞增殖活性见不同浓度ASODN均能抑制BGC 82 3细胞增殖 ,抑制作用在 48小时最强。RT PCR检测结果cyclinD1 mRNA减少。免疫组化S P法结果cyclinD1 蛋白表达明显降低。结论 :使用人工合成的cyclinD1 ASODN可以特异性的抑制胃腺癌BGC 82 3细胞株cyclinD1 的表达 ,从而调控细胞周期 ,抑制细胞增殖     

Bcl-2反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的　探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ） 对ｂｃｌ２ 基因的表达调控及诱导胃癌细胞凋亡的作用。方法　应用ＭＴＴ方法比较两条人工合成的ＡＳＯＤＮ 直接作用及其以脂质体（ＤＯＴＡＰ） 为载体对胃癌细胞的抑制效果。应用流式细胞术和ＲＴＰＣＲ 方法检测ＡＳＯＤＮ 对ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达量的调控。应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞术等方法,观察ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ 诱导ＢＧＣ８２３ 胃癌细胞凋亡的效果。结果　ＭＴＴ实验显示两条ＡＳＯＤＮ 抑制胃癌细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性,且靶位点于ｍＲＮＡ蛋白编码区（ＡＳＯＤＮ２） 和以ＤＯＴＡＰ 为载体的ＡＳＯＤＮ 对胃癌细胞的增殖抑制效果为佳。ＡＳＯＤＮ作用于胃癌细胞,降低ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达。ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ处理胃癌细胞,观察到肿瘤细胞缩小、凋亡小体出现、染色质浓缩、凋亡峰等凋亡特征性改变。结论　ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ可降低ｂｃｌ２ ｍＲＮＡ和蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡     

血管内皮生长因子受体-3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究

目的研究血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法用基因重组方法构建人反义VEGFR-3基因真核表达载体,用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用WesternBlot分析转染前后细胞中VEGFR-3蛋白的变化。利用Hoechst33258染色和流式细胞仪观察转染后Hela细胞的凋亡情况。结果转染反义VEGFR-3质粒后,Hela细胞VEGFR-3的蛋白表达水平明显下降,细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论抑制VEGFR-3的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡,VEGFR-3可能是肿瘤基因治疗的一个潜在新靶点。     

奥曲肽对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡影响的研究

目的：研究生长抑素类似物奥曲肽（octreotide,OCT）对胃癌BGC-823细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响及其可能的作用机制。方法：不同浓度的OCT作用于体外培养的人胃癌BGC-823细胞,以5～FU作为阳性对照,应用M1Tr法分析细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪测定细胞周期分布和凋亡率,AO—EB染色观察细胞形态变化。结果：OCT对BGC-823细胞的生长、增殖产生抑制作用,该抑制作用具有量效、时效关系和饱和性;OCT作用后细胞呈典型的凋亡形态学改变,流式细胞仪检测的细胞凋亡率和AO—EB染色测得细胞凋亡率与对照组相比较差异有显著性（P〈0．05）;BGC-823细胞经OCT作用后,G1期细胞数明显增加,S细胞数明显减少,细胞被阻滞于G1／S期。结论：10^-5-10^-3g/L浓度的OCT能够抑制胃癌BGC-823细胞增殖,机制可能与其诱导肿瘤细胞的凋亡和出现G1／S期阻滞有关。     

COX-2反义寡核苷酸抑制宫颈癌Hela细胞的研究

目的：通过研究环氧合酶-2（COX-2）反义寡核苷酸（AS-ODNs）对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制及对其抑制原理进行分析,探讨COX-2 AS-ODNs对宫颈癌的治疗意义.方法：Hela细胞分6组培养：对照组（A）、正义寡核苷酸（SODNS）组（B）、脂质体组（C）及反义寡核苷酸组 （D）设3个亚组.MTT实验检测细胞的增殖情况;在转染后48 h,RT-PCR法检测COX-2 mRNA的表达水平,Western blot检测COX-2蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期的变化.结果：与其他组比较,AS-ODNs转染的细胞增殖缓慢,且随着AS-ODNs的浓度增加细胞增殖指数有下降的趋势,COX-2 mRNA及蛋白表达明显下调,表达量随AS-ODNs转染浓度的增加而减少,细胞周期S期细胞比例明显减少,G2/M及G0/G1期细胞所占比例增多,P ＜0.05.结论：COX-2反义寡核苷酸对Hela细胞的增殖有抑制作用;其抑制机制可能与抑制COX-2转录与翻译及细胞周期再分布有关.     

人胃腺癌BGC-823细胞株周期素D1的表达

[目的]探讨反义核酸对周期素D1的表达及对胃癌细胞增殖的影响。[方法]应用免疫荧光组织化学方法结合激光共聚焦显微镜，观察了人胃腺癌BGC-823细胞株反义核酸处理前后周期素D1的表达。[结果]反义核酸处理组周期素D1的表达较空白对照组明显降低。[结论]反义核酸抑制周期素D1的表达并抑制胃癌细胞的增殖。