成年大鼠睾丸Smad1和Smad5的免疫组织化学研究

目的 :探讨骨形态形成蛋白的细胞内信号传导分子Smad1和Smad5蛋白在成年大鼠睾丸内的表达。　方法 :应用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶 DAB 硫酸镍铵增强技术 ,检测成年大鼠睾丸Smad1和Smad5蛋白的表达和定位。　结果 :Smad1蛋白表达于大鼠睾丸精曲小管的各级生精细胞的胞质内 ,呈淡染的紫蓝色颗粒 ,胞核为阴性 ,免疫染色阳性细胞主要包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞 ;而Smad5蛋白阳性染色不明显 ,只有睾丸间质细胞呈弱阳性反应 ,免疫反应阳性物质主要定位于细胞质。　结论 :Smad1蛋白主要表达于睾丸精曲小管各级生精细胞 ,Smad5蛋白表达于间质细胞 ,为揭示TGF β超家族在精子发生中的分子机理提供了直接证据。     

Ces5a基因在大鼠睾丸中的表达

目的:分析羧酸酯酶5a (Ces5a)基因在大鼠睾丸发育过程中的表达情况。方法:选取3组不同窝别出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 d 21个时间点的大鼠,采用RT-PCR、Western印迹、免疫组化、HE染色分别检测大鼠睾丸组织中Ces5a基因在mRNA转录水平和蛋白表达量及定位。结果:①Ces5a mRNA在大鼠出生后的第2～65天均有表达,大鼠出生后2～12 d Ces5a mRNA的表达量较低;与2～12 d相比,14～16 d的表达量下降至最低水平(P0.05);与14～16 d相比,20～35 d该表达量有显著升高(P0.05);与20～35 d相比,40～65 d的表达量有显著升高,达到高峰(P0.05)。②Ces5a蛋白在大鼠出生后第2～65天均有表达,在大鼠出生后2～12 d Ces5a蛋白的表达量较低;与2～12 d相比,14～16 d Ces5a蛋白的表达量无显著变化(P0.05);与14～16 d相比,20～35 d的表达量有显著升高(P0.05);与20～35 d相比,40～65 d的表达量无显著变化(P0.05)。③Ces5a蛋白表达于精原细胞、精母细胞及圆形精子细胞。结论:①Ces5a基因可能参与了大鼠精原细胞增殖过程及减数分裂过程;②Ces5a基因可能在圆形精子发生和精子变形过程中发挥特殊的作用。     

Smad4、Smad7在大鼠慢性前列腺炎前列腺组织中的表达及意义

目的 研究慢性前列腺炎SD大鼠前列腺组织Smad4和Smad7的表达,并初步探讨它对慢性前列腺炎发病机制的意义.方法 将40只6月龄SD大鼠随机分为正常对照组和CP实验组,每组20只.实验组采用去势+高剂量苯甲酸雌二醇肌注方法建模,并以免疫组化和蛋白免疫印迹实验方法检测Smad4、Smad7在前列腺组织中的表达变化.结果 与正常对照组相比,Smad7表达显著下调(P<0.01),Smad4表达亦显著下调(P<0.01);Smad4与Smad7在慢性前列腺炎大鼠前列腺组织中表达无相关性.结论 Smad4、Smad7在慢性前列腺炎前列腺组织中表达异常,提示可能参与CP的病理过程.     

睾丸性不育动物模型的建立

目的:探讨制作睾丸性不育动物模型的方法。方法:①X-射线局部照射:取8～10周龄的BALB/c雄鼠70只,分实验组1、2、3、4、5、6和对照组各10只。实验组1、2、3、4、5、6分别用1000、1200、1400、1600、1800、2000cGy6种不同的剂量照射睾丸局部10min;对照组不做任何处理。做受孕试验。②环磷酰胺腹腔注射:取4～5周龄的雄鼠40只,分实验组1、2、3和对照组各10只。实验组分别以30、5070mg/kg体重剂量的环磷酰胺腹腔注射,每周2次,连续注射5周;对照组腹腔注射生理盐水。做受孕试验。③达菲林腹腔注射:取8～10周龄的雄鼠20只,分实验组和对照组各10只。实验组腹腔注射0.375mg/ml达菲林0.4m,l对照组腹腔注射生理盐水0.4ml。做受孕试验。④通过脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化等病理学检查鉴定。未使雌鼠受孕的雄性小鼠定为睾丸性不育,共30只。结果:①X-射线局部照射:实验组1、2的雄鼠分别于X-射线照射后10、15d使雌鼠受孕;实验组3、4的雄鼠,经观察3个月也未能使雌鼠受孕;实验组5、6的雄鼠,于X-射线照射后第5d和第2d死亡;对照组雄鼠皆于3d内使雌鼠受孕。②环磷酰胺腹腔注射:实验组1雄鼠体重增加7g左右,停药后9～14d恢复生育能力,使雌鼠受孕;实验组2雄鼠体重增加4g左右,停药后观察3个月未使雌鼠受孕;实验组3雄鼠体重不增,呈消瘦状,分别于用药第3、4、5周相继死亡;对照组雄鼠皆于3d内使雌鼠受孕。③达菲林腹腔注射:实验组雄鼠于停药后3周左右使雌鼠受孕;对照组雄鼠皆于3d内使雌鼠受孕。④TUNEL结果:对照组睾丸组织偶见凋亡细胞,占(0.71±0.12)%;睾丸性不育组睾丸组织凋亡细胞数量明显增加,占(10.36±1.48)%,两者比较差异有显著性(P<0.05)。HE染色:对照组睾丸组织正常,生精小管呈饱满椭圆形,各级生精细胞排列有序,内含大量精子细胞;睾丸性不育组生精小管萎缩,细胞排列疏松,未见各级生精细胞,只有支持细胞,各生精小管间腔隙扩大,间质细胞减少。免疫组化染色:CD29、Hsp90α、CD117的阳性表达率对照组分别为(50.3±5.2)%、(41.6±3.5)%、(73.6±3.7)%,而睾丸性不育组明显降低,分别为(1.3±0.2)%、0%、(1.6±0.3)%(P<0.01)。p53阳性表达率对照组为(19.7±0.8)%,而睾丸性不育组明显增高,为(39.4±2.9)%(P<0.01)。结论:X-射线睾丸局部照射、环磷酰胺腹腔注射法均可制作睾丸性不育动物模型。     

输精管阻断对大鼠睾丸转化生长因子β1表达的影响

目的　了解大鼠输精管阻断和阻断解除后睾丸内TGFβ1表达状况。　方法　大鼠 90只 ,随机分为输精管阻断 (VG)组 35只 ,输精管阻断解除 (VOG)组 2 0只 ,假手术组 (SOG) 35只 ,采用免疫组织化学染色和原位杂交技术检测TGFβ1的表达。　结果　VG组从实验第 8周起近基底膜的管周细胞和精原细胞TGFβ1表达较SOG组增强 ,其中 8、16、2 0、2 4周与SOG组相比差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。表达量在 8周后并不随结扎时间延长而改变 ,而是维持在相对稳定的水平。VOG组TGFβ1表达亦较SOG组显著增高。　结论　输精管阻断后TGFβ1表达升高可能是导致睾丸细胞凋亡的原因 ,而阻断解除后TGFβ1水平无明显下降可能是导致生精功能恢复不完全的原因。     

多氯联苯对大鼠睾丸bcl-2及TGFβ1表达影响的研究

目的:探讨多氯联苯(PCB)对大鼠睾丸结构及功能的影响。　方法:选用Wistar雄性大鼠40只随机分为 4组,A组饲喂正常饲料,B组饲喂含10-8mol/LPCB饲料,C组饲喂含10-7mol/LPCB饲料,D组饲喂含10-6mol/L PCB饲料,饲喂3个月后建立慢性PCB毒性动物模型,用光镜、免疫组化技术研究PCB对大鼠睾丸结构及功能的影 响。　结果:PCB对大鼠睾丸结构的损伤同PCB剂量呈正相关,高剂量PCB组睾丸组织结构受损严重;PCB能诱 导bcl 2和TGFβ1表达,PCB能诱导睾丸组织bcl 2和TGFβ1的表达,两者的表达强度同PCB的浓度相关;高浓度 组TGFβ1的阳性率明显高于对照组和其他组(P<0.01),C组bcl 2阳性率明显高于对照组和其他组(P<0.01)。 结论:PCB对大鼠睾丸组织结构及功能产生明显的损伤作用。     

低氧对大鼠睾丸组织死亡受体5和FLIP抑制蛋白表达的影响

目的:检测常氧与模拟海拔4 000 m低氧条件下大鼠睾丸组织中死亡受体5(DR5)和FLIP抑制蛋白(c-FLIP)表达水平,以及c-FLIP在睾丸组织中的分布。方法:40只10周龄雄性SD大鼠随机分为常氧组,低氧3、15、30 d组。低氧各组分别置模拟海拔4 000 m低压舱中减压3、15、30 d;常氧组在平原(海拔300 m)喂养;减压结束后取睾丸组织,Western印迹检测睾丸组织中DR5与c-FLIP蛋白表达,免疫荧光法检测睾丸组织中c-FLIP分布。结果:低氧3、15、30 d组大鼠睾丸DR5表达量分别为2.04±0.11、1.97±0.12、2.34±0.11,均显著高于常氧组DR5的表达(1.78±0.09,P均<0.05)。低氧15、30 d组大鼠睾丸c-FLIP表达量分别为0.87±0.03、0.74±0.07,均显著低于常氧组c-FLIP的表达(1.03±0.02,P均<0.05)。结论:模拟海拔4 000 m低氧促进睾丸组织凋亡蛋白DR5表达,抑制睾丸组织抗凋亡蛋白c-FLIP表达。     

补肾中药血清对成骨细胞中Smad1/5信号转导蛋白活性的影响

目的研究补肾中药血清对离体SD大鼠成骨细胞中Smad1/5活性的变化。方法采用多次胶原酶消化法获取新生SD大鼠颅盖骨中的成骨细胞进行体外培养,并应用Gomori改良钙钴法对其进行碱性磷酸酶表达的鉴定;随机将实验用大鼠分为正常组、补肾中药组(补肾组)、骨疏康颗粒对照组(骨疏康组)、补中益气颗粒对照组(补脾组);对实验大鼠给药干预8d后,通过血清药理学的方法使用各组大鼠血清培养成骨细胞48h;应用免疫组化SABC方法检测成骨细胞中Smad1/5的活性表达。结果补肾中药血清作用于体外培养的成骨细胞48h后对于成骨细胞的增殖具有明显的促进作用,其效果优于正常组(P<0.01);成骨细胞中Smad1/5的活性表达,与正常组相比有所降低。结论成骨细胞中存在Smad1/5的表达,表明Smad1/5可能有促进成骨细胞分化、增殖的功能,对成骨细胞保持自身功能、维持骨密度的作用上发挥重要的作用。②具有益肾填精壮骨的补肾中药可以影响Smad1/5在成骨细胞中的表达,对于促进和维持成骨细胞的特性及功能具有重要作用,这可能是防治骨质疏松症的机理之一。     

趋化素样因子-1致不育小鼠睾丸曲细精管的病理改变

目的　探讨趋化素样因子 1(CKLF 1)致小鼠不育的可能机制。方法　通过以导入CKLFI质粒的不育小鼠为对象 ,观察其睾丸及曲细精管的病理改变 ,探讨小鼠不育的原因。结果导入CKLFI实验鼠不育 ;两组小鼠体重及睾丸重量差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;实验鼠曲精管内各级生精细胞层数少 ,排列紊乱 ,曲细精管壁变薄、皱缩、塌陷 ,细胞排列疏松、脱落。结论　导入CKLFI能使小鼠曲细精管发生病理改变致不育。     

Smad3和Smad7在梗阻性黄疸大鼠肝纤维化形成过程中的表达及意义

目的:研究梗阻性黄疸大鼠肝纤维化形成进程中Smad3与Smad7表达的变化及其对肝纤维化的意义。方法:Wistar大鼠60只,随机分成模型组和对照组。于术后第1天及术后7 d、14 d、28 d及35d 5个时间点模型组和对照组处死大鼠各6只。进行肝组织病理学观察,免疫组织化学法测定肝组织中Smad3、Smad7的表达情况并行半定量分析。结果:与对照组相比,模型组大鼠7、14、28、35 d肝纤维化程度逐渐增强,Smad3明显升高并有统计学意义(P0.001),Smad7明显降低并有统计学意义(P0.001);而且模型组5个时间点比较均有统计学意义(P0.001)。同时,Smad3与Smad7呈负的直线相关(r=-0.951,P001)。结论:随着胆道梗阻时间延长,肝纤维化程度逐渐加重,肝组织中Smad3表达水平显著增加,Smad7表达水平下降,Smad3与Smad7呈负的直线相关。抑制Smad3或增强Smad7的表达可能是防治肝纤维化的新途径。     

益肾填精中药对骨质疏松症模型大鼠的骨组织中Smad1/5的表达影响

目的 通过观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨中Smad1/5在细胞中的表达,探索肾虚骨质疏松症的发病机理.方法 实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,同时应用益肾填精作用的纳米钙补肾中药低、高剂量组,对模型大鼠给药干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力作为阳性对照组,以及正常对照组、假手术对照组和模型空白组,并与补脾中药补中益气汤作比较;应用双能X线骨密度仪检测离体股骨的骨密度;HE染色光镜下观察股骨形态;免疫组化SABC法检测股骨中的Smad1/5蛋白活性表达.结果 与正常组比较,模空组大鼠股骨头的骨密度显著降低,P<0.01;与模空组比较,用药12周之后各用药组均可提高模型大鼠股骨的骨密度值;HE染色光镜下观察各组大鼠右侧股骨头病理切片,模空组骨髓腔增大,骨小梁断裂,各用药组可见骨髓腔较小,形态结构较完整;与正常组相比较,模空组Smad1/5阳性表达显著下降,P<0.01;用药12周后,与模空组相比较,各用药组均可上调其表达情况,P<0.01.结论 骨组织中Smad1/5阳性表达降低可能是骨质疏松症发生的机制之一,纳米钙补肾填精中药可能通过改善和调控股骨中Smad1/5的表达,而起到防治肾虚骨质疏松症的作用.     

Smad1在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间质干细胞中的表达及意义

目的:探讨Smad1在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者骨髓间质干细胞(MSCs)中的表达及其在发病机制中的作用。方法:30例12～18岁志愿者分为两组:AIS组20例,同年龄正常对照组10例。分别从髂前上棘处骨穿刺抽取10ml骨髓,肝素抗凝。采用密度梯度离心法分离MSCs,体外培养并传至P2代行表型鉴定,分别采用RT-PCR及免疫蛋白印记法检测两组患者MSCs中Smad1的表达情况。结果:AIS组与对照组Smad1mRNA水平的平均表达率分别为4.48±0.58和1.03±0.22,蛋白水平的平均表达率分别为2.62±0.55和0.84±0.22。不论是核酸水平还是蛋白水平AIS组Smad1的表达均高于对照组(P<0.01)。结论:Smad1在AIS患者MSCs中表达强度异常,可能与AIS发病的分子机制相关。     

转化生长因子β1及其信号转导分子Smad4,Smad7在人脑胶质瘤中的表达及其意义

目的　探讨转化生长因子 β1及其超家族肽类的细胞内转导分子Smad4和Smad7在人脑胶质瘤中的表达及其意义。方法　采用免疫组织化学方法 ,对经过石蜡包埋的 3 0例胶质瘤和8例正常脑组织标本进行定位和定性检测。结果　TGF β1,Smad4和Smad7蛋白在胶质瘤中均有不同程度的表达 ,Smad4的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增高而降低 ,且在正常脑组织、低、高级别胶质瘤组中的表达差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;TGF β1,Smad7在正常脑组织中几乎不表达 ,在低级别胶质瘤 (Ⅰ Ⅱ级 )中表达较少 ,在高级别胶质瘤 (Ⅲ Ⅳ级 )中表达较多 ,两者在正常脑组织及高、低级别胶质瘤中的表达两两比较差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。且TGF β1与Smad7的表达水平呈正相关 (r =0 .78,P <0 .0 1) ;TGF β1与Smad4的表达水平呈负相关(r =-0 .67,P <0 .0 1)。结论　TGF β1,Smad7蛋白的阳性表达与组织学分级密切相关 ,它们参与了在人脑胶质瘤细胞的恶性转化 ,而Smad4对胶质瘤的进展有抑制作用。     

川芎嗪对膝骨性关节炎大鼠软骨BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表达的影响

目的观察川芎嗪治疗膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)大鼠模型关节软骨中骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、Smad1表达的变化,并探讨川芎嗪治疗KOA的作用机制。方法制作大鼠膝关节炎模型,将建模成功的大鼠纳入模型对照组,常规饲养,川芎嗪高剂量组、川芎嗪低剂量组、阳性对照组行灌,正常组和模型组行等量生理盐水治疗6 w,实验结束后,各组大鼠分别行HE切片软骨Mankin评分、Western Blot检测软骨组织BMP-2、Smad1及实时荧光定量PCR检查BMP-2mRNA、Smad1mRNA的变化。结果各组软骨Mankin评分中,川芎嗪各剂量组和阳性对照组均较空白组高(P0.05),均较模型组低(P0.05),且川芎嗪高剂量组阳性对照组川芎嗪低剂量组(P0.05)。正常组、川芎嗪各剂量组及阳性对照组中软骨BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA相对表达量较模型组均高于模型组,差异有统计学意义(P0.05);与阳性对照组相比,川芎嗪高剂量组BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表达量明显高于阳性对照组(P0.05),而川芎嗪低剂量组其表达则均低于阳性对照组。结论川芎嗪可能通过上调早期KOA大鼠BMP-2mRNA及Smad1mRNA基因的表达,从而促进BMP-2及Smad1蛋白的表达,这可能是在某种程度上减轻关节软骨退变、修复软骨损伤作用的机制之一。     

双氢睾酮对LNCaP细胞系Smad3和Smad4转录及表达的影响

目的:探讨双氢睾酮(DHT)对前列腺癌细胞系LNCaP中转化生长因子β(TGFβ)信号通路的下游信号蛋白Smad3、Smad4的基因转录及表达是否有影响,氟他胺对这些影响有无拮抗作用。方法:用含不同浓度DHT(2、10、50nmol/L)和氟他胺(100nmol/L)的RPMI1640培养液培养LNCaP细胞株。RTPCR检测LNCaP细胞中Smad3、Smad4mRNA水平,Western印迹法检测Smad3、Smad4蛋白表达情况。结果:与不含DHT和氟他胺的对照组比较,10、50nmol/LDHT明显增强LNCaP细胞中Smad3mRNA的表达(P<0.05),不同浓度的DHT均使Smad3蛋白的表达增高(P<0.05),氟他胺明显抑制DHT的这种增强作用(P<0.05);10nmol/L浓度的DHT对Smad4mRNA的转录有明显的抑制作用(P<0.05),这种抑制作用受氟他胺的抑制,不同浓度的DHT均可以使Smad4蛋白的表达下降,而且下降程度要比Smad4mRNA下降更为明显(P<0.05),氟他胺能够减轻这种抑制作用。结论:DHT能够增强Smad3mRNA的转录和表达,而对Smad4mRNA的转录和表达有抑制作用,氟他胺可以不同程度地抑制DHT的这些作用。雄激素受体(AR)信号通路和TGFβ信号通路可能在Smads水平上存在交联。     

TGF-βRⅠ、Smad2、Smad 3及Smad7在瘢痕疙瘩中的表达

目的 观察比较瘢痕疙瘩、正常瘢痕及正常皮肤中转化生长因子β1型受体（TGFβRⅠ）、Smad2、3、7的表达情况，探讨以上信号传导分子在瘢痕疙瘩形成过程中的作用。方法 运用免疫组化技术检测上述4种蛋白在3种不同组织44例标本中的表达，寻找其规律。结果 与正常瘢痕及正常皮肤相比，瘢痕疙瘩中TGF-βRⅠ表达增强，Smad7表达减弱（P〈0．05），Smad2及Smad3表达增强不显著，但在核内积聚较为明显。结论 瘢痕疙瘩中TGF-βRⅠ表达增强，Smad2、3核内持久积聚及抑制性因子Smad7表达减少，可能是瘢痕疙瘩形成的重要原因。