激光心肌血运重建术联合血管内皮细胞生长165基因治疗缺血心肌的研究

目的：观察激光心肌血运重建术（TMLR）联合血管内皮细胞生长因子165基因（VEGF165cDNA）治疗缺血心肌后心肌血管密度、心肌灌注和代谢的变化。方法：健康杂种犬48条,随机分为TMLR组、TMLR联合VEGF165cDNA组和空质粒（pcDNA3.1）组（n=12）,心肌梗死为对照组。结扎冠状动脉致心肌缺血60min后行CO2激光心肌打孔,VEGF165cDNA基因转染采用直接心肌注射法。结果：TMLR联合VEGF165基因治疗后6和12周,缺血区心肌血管密度和心肌灌注量、代谢显著高于TMLR组。结论：TMLR联合VEGF165基因治疗缺血心肌后心肌血管密度显著增加;成活心肌的数量显著增加和/或成活心肌功能显著恢复。     

血管内皮生长因子基因转染血管内皮祖细胞治疗肢体缺血的实验研究

目的利用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF-165）基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并移植到下肢缺血的新西兰兔体内,观测其促进血管新生,改善肢体缺血的效果。方法（1）梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞,然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培养液诱导培养EPCs。并以免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定。（2）用携带VEGF165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）转染所培养的细胞,ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的表达。（3）制作兔下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs、M199培养基,多种方法检测移植效果及局部整合情况。结果（1）自兔骨髓诱导出梭形贴壁细胞,免疫荧光及电镜检测证实为EPCs。（2）Adv-GFP-VEGF165成功转染EPCs,ELISA法检测转染VEGF165后的EPCs其上清液中VEGF蛋白浓度明显升高。（3）Brdu示踪显示移植细胞整合到缺血局部,CTA及免疫组化检查显示VEGF-165基因转染后的EPCs移植后其改善肢体缺血效果优于其他两组。结论VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

碱性成纤维细胞生长因子促进兔缺血后肢血管新生的实验研究

目的:了解局部应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对促进兔缺血后肢血管新生的作用。方法:25只日本大耳白兔随机分2组,外科结扎切断各兔股动脉及其分支,制作兔后肢缺血模型。试验组各兔在缺血后肢肌肉内多次注射重组人bFGF蛋白(n=15);对照组给予等剂量生理盐水(n=10)。术后4周,各兔行腹主动脉造影观察侧支血管形成情况,取内收肌和腓肠肌肌肉行病理切片HE染色应用图像分析系统统计血管密度,并用免疫组织化学方法检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。结果:试验组兔侧支循环血管条数、血管密度及VEGF阳性表达的血管数均大于对照组(P<0.01),缺血状态得到改善。结论:在兔缺血后肢肌肉中注射bFGF蛋白可促进血管新生,增加兔缺血后肢血液灌注,改善肢体缺血状态。     

转染血管内皮生长因子基因的小鼠NIH3T3细胞移植促进皮瓣早期血运重建的研究

目的探讨转染血管内皮生长因子（VEGF）基因的小鼠NIH3T3细胞移植对缺血皮瓣的血管新生和皮瓣存活率的影响。方法体外PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染小鼠NIH3T3细胞,免疫组化方法检测小鼠NIH3T3细胞体外表达VEGF的情况,CM-DiI标记小鼠NIH3T3细胞。将小鼠随机分为3组：A组[PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的NIH3T3细胞移植]、B组（单纯NIH3T3细胞移植）、C组（单纯DMEM培养基注射）。每只小鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基,注射后酶联免疫吸附（ELISA）法连续检测大鼠血浆VEGF浓度,注射后第4天掀起一个蒂在尾侧的4．0cm×1．5cm的随意皮瓣。术后第7天分别观察皮瓣的存活率、血流灌注、皮瓣毛细血管密度、NIH3T3细胞在皮瓣内的分布和存活情况。结果转染VEGF165基因的小鼠NIH3T3细胞体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A组的皮瓣存活率、毛细血管密度、血流灌注比值均显著高于另外两组（P〈0．05）。结论转染VEGF基因的小鼠NIH3T3细胞皮下移植可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

纳米血管内皮生长因子在治疗下肢缺血促进血管再生成中的作用

目的　利用家兔后肢缺血模型 ,观察纳米材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物 (poly dl lactic co glycolicacid ,PLGA) ,包载血管内皮生长因子 (VEGF16 5 )基因 ,经局部肌肉注射后 ,外源基因在局部缺血组织中的转染及强度 ,以及缺血部位的血管新生状况。　方法　制备VEGF16 5 真核表达质粒 ,制备包载VEGF16 5 基因的纳米粒子 ,并检测其理化性质和体外释放曲线。建立家兔后肢缺血模型 2 4只 ,其中4只为对照组 ,只行股动脉及其分支结扎切断术 ;2只为空白纳米粒子组 ,局部缺血肌肉注射空白纳米粒子 ;10只应用裸质粒VEGF16 5 转染 ,8只采用纳米技术包载VEGF16 5 转染。直接缺血部位肌肉内多点注射 ,进行局部定位基因转染。术后 14d行血管造影 ,了解缺血部位侧枝形成情况。处死兔子 ,取股二头肌 ,内收大肌 ,做病理切片 ,免疫组化染色 ,观察VEGF16 5 的表达 ,测定毛细血管密度。应用逆转录 聚合酶链反应了解VEGF16 5 在骨骼肌中的表达 ,并对不同的转染技术进行半定量分析。　结果　转基因治疗 14d后 ,转染VEGF基因组血管造影可见明显新生血管和侧枝循环形成 ,免疫组化染色可见VEGF16 5 蛋白表达水平增高 ,缺血肌肉血管数增多 ,纳米VEGF16 5 治疗组与裸质粒VEGF16 5 治疗组的毛细血管密度明显高于对照组 ,有显著性差异 (P     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

低氧反应元件对缺血心肌转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用

目的 观察低氧反应元件(HRE)对低氧、复氧心肌细胞及缺血心肌转染人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因表达的调控作用.方法 分离新生SD大鼠心肌细胞,采用不同氧条件进行培养;建立猪心肌缺血一复灌动物模型,将在HEK293T细胞包装后获得的rAW-9HRE.hVEGF165病毒分别转染心肌细胞及动物缺血心肌.取培养心肌细胞及培养液,另取缺血区心肌组织,采用细胞免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot方法 分别测定hVEGF165蛋白表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定hVEGF165 mRNA表达;Ⅷ因子染色,计数缺血心肌新生血管变化.结果 病毒转染率为87%;心肌细胞A、B及E组培养液中hVEGF165蛋白含量显著升高(P＜0.01),细胞免疫荧光hVEGF165蛋白染色呈阳性;RT-PCR检测显示,心肌细胞A、B及E组可见484 bp目的 条带;在动物整体水平,与转基因缺血组比较,转基因复灌组hVEGF165 mRNA及蛋白表达显著减弱(P＜0.01),心肌毛细血管密度亦减少.结论 HRE作为氧敏感基因调控开关能有效地调控缺血心肌转染hVEGF165基因的表达.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植于梗塞心肌的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植联合血管内皮生长因子（VEGF）基因转染对大鼠梗塞心肌组织的修复重建、血管再生及梗塞后心功能的影响。方法 体外分离、培养、纯化SD大鼠的MSCs，以BrdU标记MSCs，腺病毒介导VEGF基因转染MSCs。建立大鼠急性心肌梗死模型4周后，随机分为4组（每组10只），分别行梗塞心肌内注射：转染VEGF基因的MSCs移植组（组Ⅰ）、单纯MSCs移植组（组Ⅱ）、单纯VEGF基因治疗组（组Ⅲ）和以注射无血清IMDM培养液为对照组（组Ⅳ）。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果 组Ⅰ和组Ⅱ中，梗塞心肌处可见BrdU标记的移植细胞，cTnT染色阳性。超声心动图检查发现，组Ⅰ和组Ⅱ的左室射血分数（LVEF）的改善显著高于对照组（P均〈0．01），而组Ⅰ的LVEF改善程度要明显高于组Ⅱ；部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗塞区域的新生毛细血管。相对于对照组，组Ⅰ和组Ⅲ都有明显的血管新生（P均〈0．01）。结论 MSCs移植联合VEGF基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，显著改善心功能。     

人VEGF165基因转染人外周血内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染对人外周血内皮祖细胞(EPCs)的影响.方法 体外分离、培养、鉴定人外周血EPCs.实验分脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组,pcDNA3.1空质粒转染组,窄白对照组.ELISA法和硝酸还原酶法分别测定各组上清液中VEGF和一氧化氮(NO)的含量;噻唑蓝(MTT)检测它们对EPCs增殖的影响.结果 FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清液中VEGF和NO表达量明显高于其他两组(P＜0.01);VEGF质粒转染对EPCs的增殖无明显影响.结论 人外周血EPCs可以成功转染hVEGF165基因.同时能表达一定浓度的VEGF蛋白,并可促进NO的分泌,而对EPCs的活性无明显影响.该研究为进一步研究VEGF165基因和EPCs结合治疗缺血性疾病提供了实验依据.     

bFGF联合骨髓干细胞动员剂促进兔缺血后肢血管新生的研究

目的: 观察局部应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）联合干细胞动员剂对促进兔缺血后肢血管新生的作用。方法: 40只大耳白兔均切断左侧股动脉及其分支，制作兔后肢缺血模型。成模后随机分4组(每组10只):(1)bFGF组,在缺血后肢肌内多次注射重组人bFGF蛋白;(2)G-CSF组,皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）;(3) bFGF+G-CSF组，按bFGF组和G-CSF组的方法给予bFGF和G-CSF;（4）对照组，给予等量生理盐水。术后4周，各组兔行腹主动脉造影，观察侧支血管形成情况。取内收肌和腓肠肌肌组织行病理切片检查;用图像分析系统统计血管密度;用免疫组化检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。结果: 兔侧支循环血管条数、血管密度及VEGF阳性表达的血管数均依次为：bFGF+G-CSF组 > bFGF组 > G-CSF组 > 对照组 (均P<0.05)。结论: 在缺血下肢肌内注射bFGF蛋白和皮下注射骨髓干细胞动员剂均可促进血管新生，改善肢体缺血状态;但在骨髓干细胞动员的同时，联合应用bFGF蛋白效果更好，缺血肢体改善更明显。     

Synergistically therapeutic effects of VEGF165 and angiopoietin-1 on ischemic rat myocardium

PURPOSE: The aim of this study was to determine whether the combination of 2 angiogenic growth factor, vascular endothelial growth factor 165(VEGF165) and angiopoietin-1 (Ang1), could increase angiogenesis and cardiomyocyte(CM) proliferation in an infarcted myocardium. METHODS: Myocardial ischemia was induced in rats by ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery. Replication-deficient adenoviruses encoding VEGF165 (Ad-VEGF165), Ang1 (Ad-Ang1) or enhanced green fluorescence protein (Ad-EGFP) was injected into the ischemic myocardium immediately. Bromodexyuridine (BrdU) was administered intraperitoneally 1 week after ligation. One week later, the hearts were harvested and sectioned for hematoxylin-eosin (HE) and immunohistochemistry to evaluate densities of capillary, arteriole and double labelled BrdU(+) CM. M-mode echocardiography was used to evaluate the cardiac function. RESULTS: Ang1 significantly increased collateral vessel formation. Both VEGF165 and Ang1 significantly increased densities of capillary and arteriole, as well as the number of double labelled BrdU(+) CM, and improved cardiac function. CONCLUSION: Our results suggest that the combination of VEGF165 and Ang1 can increase both myocardial angiogenesis and CM proliferation following myocardial ischemia in rats, leading to improved cardiac function.     

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。     

Efficacy of photocrosslinkable chitosan hydrogel containing fibroblast growth factor-2 in a rabbit model of chronic myocardial infarction

BACKGROUND: Therapeutic angiogenesis in ischemic myocardium has been shown to be an effective strategy to improve regional blood flow and myocardial function. However, no effective delivery system for growth factor administration is yet known to induce important therapeutic angiogenic responses in ischemic myocardium. MATERIALS AND METHODS: FGF-2-incorporated chitosan (FGF-2/chitosan) hydrogels were immobilized on the surface of ischemic myocardium of rabbit models of chronic myocardial infarction by UV-irradiation. After 4 weeks, cardiac functional analyses by noradrenalin challenge and histopathological analyses were performed to evaluate the efficacy of a controlled release of FGF-2 from FGF-2/chitosan hydrogel immobilized on the surface of ischemic myocardium. RESULTS: Significant improvement by application of FGF-2/chitosan hydrogels was found in systolic pressure at the left ventricle, +dp/dt maximum, and -dp/dt maximum during noradrenalin challenge at a dose of 1 microg/kg/min. Histological observations showed that a significantly larger amount of viable myocardium and CD 31 immunostained blood vessels were found in the FGF-2/chitosan hydrogel-applied group than only the chitosan-applied and control groups. CONCLUSIONS: These preliminary results indicate that the controlled release of biologically active FGF-2 molecules from FGF-2/chitosan hydrogel induces angiogenesis and possibly collateral circulation in ischemic myocardium, thereby protecting the myocardium.     

血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞的表达

目的检测兔骨髓间充质干细胞(BMSc)经血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后外源基因的表达，为进一步利用经基因转染的BMSc构建血管化组织工程骨组织打下基础。方法构建VEGF真核细胞表达载体，利用脂质体介导转染兔BMSc，使用原位杂交、免疫组织化学的方法检测VEGF165在BMSc中的表达。结果成功构建VEGF真核细胞表达载体，原位杂交、免疫组化方法显示经基因转染的BMSc中有阳性棕黄色颗粒出现，而未转染组呈现阴性结果。结论采用基因转移技术可以将VEGF转染至．BMSc中，并有外源性基因和蛋白的表达。     

应用转血管内皮生长因子基因治疗肢体缺血的研究

目的研究肌肉内转血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗肢体缺血的可行性,比较各种治疗方法的疗效. 方法雄性新西兰大白兔50只,完全切除股动脉后随机分为3组.实验组为明胶海绵携载法转基因组(n=18)和肌肉内注射转基因组(n=18);只注射pcDNA3为对照组(n=14).通过直接注射法及明胶海绵携载法将构建的质粒pcDNA3-VEGF121基因转入缺血肌肉内,立即测定各组肢体髂内动脉血流量,在术后2天,1、2、3和4周应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定基因表达,术后30天通过测定缺血肢体髂内动脉血流量、动脉血管造影及组织学观察测定血管密度,评价侧支循环变化. 结果术后2天,转VEGF基因治疗的两实验组均测到基因表达,并均维持2周.术后立即测定的髂内动脉血流量各组间无明显差异.术后30天,缺血肢体髂内动脉血流量、肢体血管造影血管数目和肌肉组织血管密度转VEGF基因的两实验组均比对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01),明胶海绵携载组较直接注射组亦有明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论肌肉内转VEGF基因治疗可促进急性缺血肢体侧支循环、改善血供,明胶海绵携载法较直接注射法有更好的疗效.     

CO2促缺血下肢侧支循环建立的实验研究

目的：观察经股动脉主射CO2对兔缺血下肢侧支循环形成作用。方法：采用新西兰大白兔，建立兔急性下肢缺血模型。将模型兔分成两组，实验组10条，每日经股动脉注射95％的CO2（2ml/kg）；对照组6条，每日只注射与实验组等量的肝素生理盐水，共20d，20d后行血管造影、病理、免疫组化染色检查，评价各组侧支血管形成状况。结果：实验组较对照组动物下肢缺血部位新生血管明显增多，侧支循环形成。结论：CO2能加速扩张下肢动脉侧支血管，加速缺血区动物侧支循环的建立，增加下肢缺血区微血管的密度，改善缺血区的血液供应，并有效的保护下肢功能。     

Therapeutic angiogenesis in chronically ischemic porcine myocardium: comparative effects of bFGF and VEGF

BACKGROUND: Both vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) have been used in preclinical studies to induce new blood vessel growth in ischemic cardiac muscle with promising results. However, clinical trials have been much less convincing and further work is needed. This study expands on prior work by comparing the long-term proangiogenic effects of direct intramyocardial (IM) injection of bFGF, as well as IM and intravenous (IV) VEGF in a porcine model of chronic hibernating myocardium. METHODS: Mini-swine with proximal 90% left circumflex (LCx) coronary stenosis subtending chronically ischemic, viable (hibernating) myocardium by positron emission tomography (PET) and dobutamine stress echocardiography (DSE) were randomized to IM bFGF (n = 5), IM VEGF(165) (n = 5), IV VEGF(165) (n = 5), IM vehicle (n = 5), or sham redo-thoracotomy (n = 4). The bFGF protein was administered in a total dose of 1.35 microg divided into 30 IM injections. IM VEGF(165) protein was administered in a total dose of 15 microg/kg divided into 30 injections; IV VEGF(165) was given at a dose of 50 ng. kg(-1). min(-1) for 200 minutes at three 72-hour intervals (30 microg/kg total dose). After 3 and 6 months the PET and DSE studies were repeated, and the animals were sacrificed for tissue vascular density and angiogenic protein analysis. RESULTS: Myocardial blood flow (MBF) by PET was significantly improved 3 months posttreatment in the IM bFGF and IM VEGF(165) groups, differences that were sustained at 6 months. There was no significant increase in MBF 3-months posttreatment in the IV VEGF(165) group; however, at 6 months MBF was significantly improved. No change in MBF was seen in the IM vehicle or sham groups. Regional wall motion at rest and peak stress in the LCx region demonstrated small but statistically significant improvements by 6 months in the IM bFGF and IV VEGF(165) groups only; no improvement was seen in the IM VEGF(165), IM vehicle, or sham groups. Quantitative vascular density was significantly increased in the LCx regions of all treatment groups (IM bFGF, IM VEGF(165), IV VEGF(165)) 6-months postoperatively. No significant increase in LCx region myocardial bFGF or VEGF protein levels was seen in the treated animals at 6 months. CONCLUSIONS: The IM bFGF, IM VEGF(165), and IV VEGF(165) all improve regional perfusion and vascular density 6-months posttherapy in the animal model utilized. Functional improvements were less consistent. Both bFGF and VEGF(165) may be useful therapies for improving regional perfusion in chronically ischemic myocardium, although combination therapy with additional growth factors or cellular therapies may be necessary if concomitant improvements in function are to be seen.