VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

应用表达载体介导siRNA抑制乳腺癌细胞MCF-7血管内皮生长因子-C基因的表达

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的抑制作用. 方法 设计合成一对编码后可形成小发夹结构针对VEGF-C基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建VEGF-CsiRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染MCF-7细胞,半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测转染前后MCF-7细胞VEGF-C基因表达的变化. 结果 PCR和DNA测序证实,携带VEGF-CsiRNA表达载体构建成功,VEGF-C基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P<0.05),在mRNA水平其表达抑制率为61.8%;在蛋白表达水平其表达抑制率为78.3%. 结论 本研究构建的VEGF-CsiRNA表达载体可有效抑制MCF-7细胞VEGF-C的mRNA和蛋白表达,为进一步以VEGF-C为靶点的乳腺癌治疗实验研究奠定了基础.     

RNAi对B系淋巴瘤Namalwa细胞中VEGF表达和增殖的影响

目的 应用RNA干扰 (RNA interference,RNAi) 技术抑制VEGF的表达,观察其对B系淋巴瘤细胞株Namalwa生物学行为的影响.方法 设计3条针对人VEGF mRNA的siRNA序列,经脂质体转染至Namalwa细胞.采用RT-PCR、Western blot法检测转染后Namalwa细胞VEGF mRNA和蛋白的表达.结果 siRNA-2组VEGF mRNA及其蛋白的表达明显减少(P<0.01),siRNA-2组细胞体外增殖能力减弱(P<0.05).结论 RNAi技术可明显抑制Namalwa细胞VEGF的表达及细胞的体外增殖.     

RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

siRNA沉默SCD1基因对MCF-7细胞增殖、凋亡及脂质代谢的影响

目的:通过小干扰RNA (siRNA)干扰技术研究SCD1基因沉默对MCF-7细胞增殖、凋亡和脂质代谢的影响.方法:以脂质体lipofectamine2000包裹siRNA的方法沉默SCD1基因,RT-PCR检测SCD1 mRNA相对表达量;Western blot法检测SCD1蛋白表达量;MTT法检测转染MCF-7细...     

下调血管内皮生长因子-C基因表达对乳腺癌MCF-7细胞侵袭抑制作用的研究

目的 探讨下调乳腺癌MCF-7细胞中血管内皮生长因子(VEGF)-C基因的表达后对乳腺癌细胞侵袭能力的影响.方法 脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C转染乳腺癌MCF-7细胞株.荧光定量PCR及Western印迹检测转染后对乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C mRNA和蛋白质水平的影响.Transwell体外侵袭实验检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力.RT-PCR检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞中MMP-2、-9 mRNA表达变化.结果 转染后获得稳定表达的细胞株.转染后的乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P<0.05).Transwell体外侵袭实验显示,转染后重组质粒组与阴性质粒相比,穿膜数明显减少(29.0±1.9比59.0±2.1,P<0.05).RT-PCR显示,转染后乳腺癌细胞的MMP-2、-9 mRNA表达均明显受抑制,抑制率分别为55%、75%(P<0.05).结论 下调VEGF-C表达对乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力有显著抑制作用.     

沉默KDR基因乳腺癌MCF-7细胞的生物学特征改变

背景：随着基因工程以及肿瘤生物分子学等新兴学科的发展壮大,基因治疗肿瘤成为一种新的治疗模式。 目的：探讨KDR基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖能力和侵袭能力的影响。 方法：设计针对KDR基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列,转染人乳腺癌MCF-7细胞,应用RT-PCR及Western blot法检测沉默KDR基因后MCF-7细胞KDR mRNA及蛋白的表达;应用流式细胞仪、CCK-8 增殖实验、小室侵袭实验检测沉默KDR基因后乳腺癌MCF-7细胞的细胞周期、增殖能力、侵袭能力的变化。 结果与结论：KDR基因沉默48 h后,乳腺癌MCF-7细胞KDR mRNA及蛋白表达明显降低;乳腺癌MCF-7细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,细胞增殖得到显著抑制,穿过滤膜的细胞数量明显减少。上述结果表明沉默KDR基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭能力得到明显抑制,说明KDR基因沉默可能成为新的有效治疗乳腺癌的靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

靶向PCNA基因的小干扰RNA对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响

目的： 研究小干扰RNA抑制PCNA基因表达后对鼻咽癌CNE2细胞株增殖及细胞周期的影响。方法: 利用体外合成法合成针对PCNA基因的小干扰RNA(siRNA)序列,应用脂质体转染鼻咽癌CNE-2细胞,实时定量PCR(real-time PCR) 和免疫组织化学法观察siRNA干扰后细胞中PCNA mRNA水平和PCNA蛋白表达,倒置相差显微镜观察转染前后CNE2细胞的生长变化,流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期。结果: 在siRNA转染CNE2细胞后,细胞增殖受到抑制,蛋白表达不同程度降低,对PCNA mRNA水平的抑制达98.5%,细胞周期在G0/G1停滞。结论: siRNA可在鼻咽癌中有效发挥RNA干扰效应,抑制PCNA mRNA及蛋白表达,降低PCNA活性,抑制鼻咽癌细胞增殖,为鼻咽癌基因治疗提供了新的方法。     

小干扰RNA抑制RUNX2对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡与侵袭的影响

目的探讨小干扰RNA抑制人RUNT相关转录因子2(RUNX2)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡与侵袭的影响。方法应用化学合成小干扰RNA技术沉默人乳腺癌MCF-7细胞中RUNX2基因的表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验验证基因沉默效率。应用MTT方法检测细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。结果设计的siRNA能够明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞RUNX2的表达。RUNX2基因沉默后,人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力降低,细胞凋亡率明显提高,侵袭能力显著降低(P<0.01)。结论RUNX2基因是治疗人乳腺癌MCF-7细胞的潜在靶点。     

RNA干扰Skp2基因抑制T47D乳腺癌细胞生长

目的构建S期激酶相关蛋白2（skp2）RNA干扰真核细胞表达载体,研究skp2基因沉默对乳腺癌T47D细胞生长的抑制作用。方法应用Ambion公司在因特网上的设计程序设计小干扰RNA。构建3个不同的重组体转染T47D细胞,RT-PCR和Western Blotting检测skp2基因表达,细胞计数分析Skp2RNA干扰对肿瘤细胞增殖的影响。结果重组体经PCR和测序证实准确连接。转染重组体的细胞skp2的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降。重组体转染的细胞增殖明显降低。结论用RNA干扰下调skp2表达抑制乳腺癌细胞生长,skp2可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。     

KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNAi)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱导RNAi,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,RT-PCR,Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化.采用阳离子聚合物纳米粒In vivo jetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤,监测肿瘤生长变化,RT-PCR,免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化.结果:靶向KDR基因siRNA转染MCF-7后,细胞增殖被抑制,KDRmRNA和蛋白的表达明显降低;裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR,免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调.各对照组指标无明显变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法,而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点.     

siRNA下调RRM2抑制人乳腺癌细胞增殖与迁移及其裸鼠皮下移植瘤的生长

目的: 探讨siRNA下调核糖核苷酸还原酶M2(ribonucleotide reductase M2,RRM2) 基因对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖、迁移和体内成瘤的影响。方法: 实时定量荧光PCR (real-time PCR) 及Western blotting技术检测人乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中RRM2 mRNA及蛋白的表达;用合成的siRNA-RRM2不同时点和不同剂量转染MCF-7细胞,用real-time PCR检测对RRM2基因的沉默效率;用CCK-8方法检测细胞增殖;用Transwell细胞迁移系统检测siRNA-RRM2对MCF-7细胞迁移能力的影响;裸鼠移植瘤实验检测siRNA-RRM2沉默MCF-7细胞的RRM2基因后对肿瘤生长的影响。结果: MCF-7细胞RRM2 mRNA和蛋白比MCF-10A细胞高表达;用siRNA-RRM2转染MCF-7乳腺癌细胞能时间及剂量依赖性下调RRM2基因表达;CCK-8方法结果显示下调RRM2基因会时间及剂量依赖性抑制MCF-7细胞增殖,而人正常乳腺上皮细胞增殖没有显著变化;Transwell细胞迁移系统检测显示下调RRM2基因显著抑制了MCF-7细胞的迁移能力;转染siRNA-RRM2下调RRM2基因能显著抑制裸鼠移植瘤的生长。结论: RRM2的过表达与人乳腺癌细胞的高增殖和迁移能力有关,抑制RRM2的功能是治疗乳腺癌的一个潜在的治疗策略。     

Silencing of TMSG1 enhances metastasis capacity by targeting V-ATPase in breast cancer

TMSG1, as a novel tumor metastasis suppressor gene, has been demonstrated to closely relate to the metastasis and drug-resistant of breast cancer. However, its molecular mechanism is still unclear. In this study, we explored the effect of small interference RNA (siRNA) targeting TMSG1 on the invasion of human breast carcinoma cell line MCF-7 and its molecular mechanisms associated with the extracellular pH. qRT-PCR and Western blot analysis revealed dramatic reduction of the levels of TMSG1 mRNA and protein after transfection of siRNA in MCF-7 cells. Cell migration and invasion were obviously increased by TMSG1 siRNA treatment. The activity of vacuolar ATPase (V-ATPase) and MMP-2 was significantly increased in MCF-7 cells transfected with the TMSG1 siRNA compared with the controls. Furthermore, acidic intracellular environment significantly increased the MMP-2 activity and the capacity of cell migration and invasion. In conclusion, silencing of TMSG1 increased V-ATPase activity, decreased extracellular pH and in turn the activation of secreted MMP-2, which ultimately promoted metastasis capacity of breast cancer cell.     

BCSG1-siRNA在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌移植瘤组织中乳腺癌特异性基因BCSG1表达的抑制作用.方法 根据BCSG1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA,分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染人乳腺癌细胞系MCF7细胞中,以无关序列转染和未转染的MCF7细胞为对照.将用上述4条特异性siRNA和无关序列转染后的细胞连同未转染的MCF7细胞(共6组细胞)注入裸鼠皮下,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分析肿瘤生长抑制情况.采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学SP法分别检测6组裸鼠移植瘤中BCSG1 mRNA和BCSG1蛋白的表达情况.3组人肿瘤组织(浸润性导管癌、癌旁乳腺导管增生组织和乳腺纤维腺瘤)同时用作对照.结果 BCSG1-siRNA转染的4组的抑瘤率均明显大于无关序列转染组及未转染对照组(P＜0.01);与无关序列转染组及未转染对照组相比,BCSG1-siRNA转染的4组肿瘤组织中BCSG1蛋白的表达明显减弱;未转染细胞对照组和无关序列转染组、人乳腺浸润性导管癌组均有大量BCSG1 mRNA阳性条带,而在BCSG1-siRNA转染的4组中,仅有少量BCSG1较弱的mRNA阳性条带,与未转染细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 BCSG1-siRNA能有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠乳腺癌组织中BCSG1蛋白及mRNA的表达.     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α逆转乳腺癌的耐药性

目的观察RNA干扰缺氧诱导因子（HIF）-1α逆转乳腺癌耐药性的作用.方法构建靶向缺氧诱导因子-1α的短发夹状小干扰RNA基因并转染到人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR中.常规MTY法检测细胞存活率,外排实验检测细胞的P-糖蛋白转运功能,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因1（mdr-1）mRNA变化,Western印迹法观察干扰前后HIF-1α、P-糖蛋白的变化.结果测序证实成功构建HIF-1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer-HIF,转染空质粒ADR/neo不影响肿瘤细胞的耐药性.MTT法检测ADR/shRNA组细胞存活率由76%下降到43%,Rh123荧光强度由22.0%升为86.6%,ADR/shRNA组中HIF-1α、mdr-1mRNA、蛋白水平显著降低（P＜0.05）,且Spearman相关分析HIF-1α和mdr-1指数在三组中显示呈正相关（r=0.816,P＜0.01）.结论成功构建了HIF-1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer-HIF,可显著降低乳腺癌MCF-7/ADR细胞中HIF-1α表达从而起到逆转肿瘤耐药的作用.     

特异siRNA抑制宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒16型E6表达的研究

目的 优化HPV-16 E6癌基因特异的U6质粒表达的siRNA，抑制HPV癌基因表达及其对子宫颈癌细胞生长繁殖的影响。方法 选择4个分别针对HPV-16 E6 mRNA外显子和内含子序列为靶序列，合成DNA链，构建表达HPV-16 E6短发卡样dsRNA的重组pSilencer1．0-U6载体，导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞中HPV-16 E6、E7基因表达水平及其蛋白含量的变化，并观察细胞生长被抑制的情况。结果 4种HPV-16 E6 siRNA均能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率。通过细胞生长曲线观察到HPV-16 E6 shRNA表达质粒导入细胞0-96h内，可降低细胞生长速度。荧光定量RT-PCR检测HPV-16 E6 siRNA可使宫颈癌细胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因转录的mRNA水平降低，其中针对E6 mRNA内含子的重组shRNA只抑制E6基因的表达水平。Western blot分析表明，4个HPV-16 E6 siRNA作用72h后，未能检测到宫颈癌细胞中HPV-16 E6蛋白。结论 HPV-16 E6 siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。