人剪切修复基因XPD对人肝癌SMMC-7721细胞中Ets-1和Cdk6基因的调控作用

目的:观察野生型人剪切修复基因XPD转染入人肝癌细胞SMMC-7721后,细胞内Ets-1和Cdk6基因的表达变化及对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过Lipofectamine 2000TM转染SMMC-7721细胞。设重组质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD)组、空载质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2(N2)组、脂质体组、无转染空白对照组。分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中XPD、Ets-1、Cdk6基因mRNA和蛋白质的表达量,并用流式细胞仪检测细胞周期变化,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活力。结果:XPD组中的XPD的mRNA和蛋白质表达较其他3组明显增高(P<0.001),而Ets-1、Cdk6 mRNA和蛋白质表达较其他3组明显减少(P<0.001)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后细胞停滞在G1期,难于进入S期。转染了野生型XPD的SMMC-7721细胞增殖能力减弱。结论:XPD基因可能通过抑制Ets-1、Cdk6基因的表达影响肝癌细胞的生长。     

人剪切修复基因XPD对p52和p21基因的影响

目的:探讨人剪切修复基因XPD转染人HepG2肝癌细胞后p52和p21基因表达的变化以及对肝癌细胞生长的影响。方法:人肝癌细胞HepG2为靶细胞,XPD基因通过Lipofectamine2000脂质体转染HepG2。将细胞分为重组质粒HepG2-pEGFP-N2-XPD组(XPD组)、空载质粒HepG2-pEGFP-N2组(N2组)和HepG2空白对照组。分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Westernblot)法检测各组细胞中XPD、p52以及p21的mRNA和蛋白质的表达量,并用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测各组细胞的增殖能力。结果:XPD组中的p52的mRNA表达较其他2组显著下调,XPD、p21的mRNA表达较其他2组明显上调(均P<0.01)。Westernblot检测结果显示各组细胞中XPD、p52及p21的蛋白表达各组间差异与其mRNA各组间差异一致。MTT检测显示XPD转染入HepG2后细胞增殖能力减弱。结论:XPD基因可以抑制癌细胞的生长和基因p52的表达,促进p21的表达。     

XPD/P44亚复合物对人肝癌细胞的生物学影响

目的:应用P44反义寡核苷酸转染人肝癌细胞SMMC-7721,探讨XPD/P44亚复合物对人肝癌细胞的生物学影响。方法:应用P44反义寡核苷酸转染人肝癌细胞SMMC-7721,同时用未做处理的SMMC-7721作为空白对照。用RT-PCR、Western blot法检测转染P44反义寡核苷酸后细胞内P44,XPD以及cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A表达量的变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)和流式细胞仪检测细胞增殖及其细胞周期的变化。结果:P44基因反义寡核苷酸转染人肝癌细胞SMMC-7721后,人剪切修复基因XPD mRNA及其蛋白的表达量显著减少,同时细胞周期调控基因cdk7、cdk2、c-myc和cdc25A mRNAs及其蛋白的表达量上调,肝癌细胞增殖明显。结论:XPD基因的表达受其分子伴侣P44的调节,XPD的作用需要有P44的参与;XPD/P44亚复合物可能是通过DNA损伤检控点来调控细胞周期的。     

POLD1基因反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用北大核心CSCD

目的研究DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及相应机制。方法将SMMC-7721细胞分为3组:实验组、阴性对照组、空白组。实验组及阴性对照组分别将POLD1基因反义RNA表达质粒及空质粒分别转染至SMMC-7721细胞,未经处理的SMMC-7721细胞为空白组。用聚合酶链反应法检测各组细胞POLD1基因表达情况;用细胞计数-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;用流式细胞术分析细胞凋亡率;用蛋白质印迹(Western blot)法检测p53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等凋亡相关蛋白表达量。结果实验组、阴性对照组和空白组肝癌细胞POLD1基因相对表达量分别为0.18±0.03,1.03±0.18和1.00±0.00;转染72 h增殖情况(OD_(450)值)分别为0.57±0.06,0.73±0.09和0.77±0.12;凋亡率分别为(23.43±4.12)%,(9.12±1.03)%,(1.24±0.14)%,实验组的上述指标与阴性对照组和空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论POLD1基因反义RNA可显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,且能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡。     

p 16 基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究

目的探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用。方法将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;经Western blot证实,转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。     

XPD和P53对HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒X蛋白表达的影响

目的:探讨人着色性干皮病基因D(XPD)和P53对人肝癌细胞株HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)、Bcl-2和Bax基因表达的影响.方法:用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染HepG2.2.15细胞,转染后第2天给予20 μmol/L的Pifithrin-α(P53抑制剂)孵育24h.分为空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组及Pifithrin-α组.用RT-PCR和Western blotting方法检测XPD、HBx、Bcl-2和Bax表达的变化;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期.结果:(1)重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(均P＜0.001);XPD表达增高使得HBx和Bcl-2表达降低,同时使得Bax表达增高,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(均P＜0.01).(2)XPD表达增高抑制了细胞增殖活力,而Pifithrin-α能抑制XPD降低细胞活力的作用(均P＜0.001).(3)XPD表达增高引起了细胞G1期增加、S期减少,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(均P ＜0.001).结论:XPD是通过P53途径抑制肝癌细胞增殖,下调HBx和Bcl-2的表达并上调Bax的表达;XPD、P53和HBx三者之间能相互作用、相互影响,共同调节肝癌的发生与发展.     

siRNA沉默p62基因对人肝癌细胞Hep3B的生物学影响

目的:探讨siRNA沉默人肝癌细胞Hep3B中p62基因对人肝癌细胞的生物学影响.方法:人肝癌细胞Hep3B为靶细胞,siRNA通过Lipofectamine 2000转染Hep3B.首先从3条siRNA序列中筛选出1条沉默p62的最佳序列,然后将细胞分为空白对照组、siRNA组、Ncontrol(NC)组及脂质体(Lip)组.分别用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中p62、XPD、p53以及cyclinD1的mRNA和蛋白质的表达量,并用MTY法检测各组细胞的增殖能力.结果:siRNA组中p62、XPD、p53的mRNA表达较其他3组显著下调(P<0.01),而siRNA组中cyclinD1的mRNA表达较其他3组明显七调(P<0.01).Western blot检测结果显示各组细胞中p62、XPD、p53及cyclinD1的蛋白表达变化趋势与其mRNA变化趋势相一致.MTT检测显示siRNA沉默p62后,细胞增殖能力增强.结论:p62基因可能通过影响XPD、p53及cyclinD1从而抑制癌细胞生长,并且可能通过DNA损伤检控点来调控细胞增殖.     

人nanog-delta48基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,检测其在肝癌SMMC-7721细胞中的表达。方法:通过RT-PCR的方法克隆nanog基因的选择性剪接变异体nanog-delta48全长编码序列,连接入pMD18-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pcDNA5/FRT,构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,测序无误后经脂质体介导转染到SMMC-7721细胞中,通过RT-PCR初步鉴定其在SMMC-7721细胞中的表达,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后的细胞增殖活力。结果:成功克隆nanog-delta48基因全长编码区,测序证明pcDNA5/FRT-nanog-delta48重组真核表达载体构建成功,使其在SMMC-7721细胞中过表达,MTT检测nanog-delta48转染入SMMC-7721细胞后,增殖能力增强。结论:剪接变异体nanog-delta48基因可能具有与nanog基因类似的活性。     

SUMO-1基因siRNA抑制肝癌细胞SMMC-7721生长的研究

目的:研究SUMO-1基因siRNA沉默人肝癌细胞SMMC-7721中SUMO-1基因表达的效果及对SMMC-7721生长的影响.方法:将人工合成的针对SUMO-1基因的siRNA片段转染体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721,采用RT-PCR、Western blot方法在mRNA及蛋白水平检测siRNA沉默肝癌细胞中SUMO-1基因的效果.通过MTT、流式细胞仪及TUNEL试验检测SUMO-1基因沉默后对肝癌细胞生长的影响.结果:人工合成的针对SUMO-1基因的siRNA片段能显著地抑制SMMC-7721 中SUMO-1基因的表达,48 h抑制率可达73.43%.MTT结果显示肝癌细胞SMMC-7721转染SUMO-1 siRNA后生长明显受到抑制,流式细胞仪检测G_2期细胞明显增加,但TUNEL试验未发现凋亡细胞.结论:SUMO-1 siRNA沉默肝癌细胞SMMC-7721 中SUMO-1基因效果良好,SUMO-1基因控制SMMC-7721的生长,SUMO-1基因是肝癌生长的一个重要的调控因素.     

高强度聚焦超声联合脂质体介导p53基因转染胰腺癌细胞的实验研究

目的探讨高强度聚焦超声(HIFU)联合脂质体介导p53基因转染胰腺癌细胞的可行性以及转染后对细胞生物学行为的影响。方法实验分为5组:Ⅰ组为单纯细胞组,Ⅱ组为HIFU+质粒组,Ⅲ组为HIFU+脂质体+质粒组,Ⅳ组为脂质体+质粒组,Ⅴ组为单纯质粒组。每组予以相应处理后,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞p53mRNA表达情况,四甲基偶氮唑盐(MTT)法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡的情况。结果荧光显微镜下见Ⅲ组有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率为10.6%),Ⅱ组及Ⅳ组有少量的荧光细胞(转染率分别为1.2%,4.8%);Ⅴ组仅有极少的荧光细胞(0.3%);Ⅰ组无荧光表达;Ⅲ组和Ⅳ组经RT-PCR法均检测到p53mRNA表达,且2组灰度值差异有统计学意义(P<0.05);MTT结果显示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞均有明显的生长抑制作用,而其中Ⅲ组的增殖抑制作用最为明显,与其他各组比较差异具有统计学意义(P<0.05);Ⅲ组细胞凋亡率为(14.5±1.6)%,与其他4组比较,凋亡率明显增高(P<0.05)。结论 HIFU联合脂质体可提高p53质粒转染率;p53质粒转染后促凋亡作用增强,肿瘤细胞生长进一步受到抑制。     

恶性淋巴瘤诊断中荧光原位杂交分析基因状态的研究

目的 探讨恶性淋巴瘤中基因重排的特点.方法 回顾性分析87例恶性淋巴瘤组织样本,利用荧光原位杂交技术,分别检测弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤中BCL-6、BCL-2、MALT1、CCND1、C-MYC和ALK基因重排.结果 弥漫大B细胞性淋巴瘤中BCL-6基因重排的阳性率为29.03％(9/31),滤泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排的阳性率为61.11％(11/18),黏膜相关淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排的阳性率为47.37％(9/19),套细胞淋巴瘤中CCND1基因重排的阳性率为88.88％(8/9),Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排的阳性率为100％(2/2)和间变性大细胞淋巴瘤中ALK基因重排的阳性率为75.00％(6/8).结论 基因重排对恶性淋巴瘤的诊断具有重要的实际价值.     

精蛋白在改进非病毒载体基因转染中的应用

非病毒基因载体的出现,为基因治疗提供了低毒、易于大规模制备的载体。但与病毒载体相比,非病毒基因载体的转染效率仍然偏低,阻碍了非病毒基因载体的临床应用。本文旨在探讨精蛋白在改进非病毒基因载体方面的应用,希望通过合理的载体设计与优化,制备出一种高效、低毒的基因载体。     

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA抑制大肠癌细胞增殖的作用

采用1个载体编码2个shRNA技术, 构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体, 研究其对人大肠癌细胞生长协同抑制的增效作用。构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体并转染大肠癌细胞, 通过RT-PCR和Western blotting方法检测Livin基因与Survivin基因的表达, 利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。经酶切鉴定和测序分析证实Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功, 它对大肠癌细胞Livin和Survivin mRNA的抑制率分别为27.90%和32.24%, 对Livin和Survivin蛋白表达的抑制率分别为22.28%和40.86%, 诱导肿瘤细胞凋亡率为 (11.69 ± 1.37) %, 但协同干扰作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功并能抑制Livin基因和Survivin基因的表达, 但协同抑制作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。     

激活沉默基因以获取抗生素的发展动态

随着基因工程技术的不断发展和成熟,通过遗传学途径筛选新抗生素和新活性物质的方法不断出现.本文综述了采用基因工程手段激活沉默基因以开发新型抗生素和活性物质的发展动态.较为具体的介绍了两个采用此种方法取得成功的实例,为今后的科研工作提供参考.     

肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2／CD，pH2／UPRT的构建

目的利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应，构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2／CD和pH2／UPRT。方法用PcR的方法从质粒pGEX／CD和pGEX／UPRT中扩增出CD基因和UPRT基因，用内切酶BamHI和SalI酶切CD基因，UPRT基因和质粒pH2，分别连接后重组于大肠杆菌中。用电转化的方法将重组质粒转人婴儿双歧杆菌中。通过双酶切和基因测序的方法检验质粒pH2／CD和pH2／UPRT的正确性，RT—PCR检测该系统的mRNA表达。在黑色素瘤B16-F10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果。结果成功地将CD基因和UPRT基因转入了乳酸菌表达质粒pH2，在纯化后的质粒被双酶切后，CD基因被分割为6．9kb和1．3kb的两部分，UPRT基因被分割为6．9kb和620bp的两部分。CD基因和UPRT基因的测序结果表明序列与Genebank公布的序列一致。RT—PCR检测到CD和UPRTmRNA的明显表达。黑色素瘤细胞的低存活率证明pH2／CD，pH2／UPRT自杀基因治疗系统对黑色素瘤的强大杀伤作用。结论肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2／CD，pH2／UPRT构建成功并显示出强大的杀伤肿瘤细胞的作用。     

Future prospects for gene delivery systems

Introduction: Gene therapy is the challenging area of biotechnology. Despite its promise for critical diseases, it has serious safety and efficiency issues, particularly with regards to gene transfer systems.

Areas covered: We examined the current situation with gene transfer systems and addressed problems this technology. We then searched patent applications about in the area from the Patentscope online system, the international patent database. We analyzed the data obtained to get a general idea about gene delivery systems designed for future use and assessed approaches for more efficient, safer and valid delivery systems.

Expert opinion: When quality assurance terms are fulfilled, some of these issues (genetic changes, mutations) could be minimized during the production process. Modification of vectors for improving their efficiency and safety or development of alternative transfer systems could be the solutions for these problems. Gene transfer technologies are important for gene therapy and should demonstrate effective, target-specific and acceptable safety profiles. For this reason, searching for alternatives to current systems is a necessity.     

RT-PCR检测胃癌NY-ESO-1抗原的表达及其基因克隆

目的 研究NY-ESO-1基因在胃癌中的表达,以便了解胃癌患者是否可以使用NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法 采用RT-PCR方法检测NY-ESO-1基因在60例胃癌组织和相应的癌旁正常组织中的表达,采用分子克隆的方法从胃癌组织中克隆了NY-ESO-1 cDNA。结果 NY-ESO-1基因在胃癌组织中的表达率为55％(33／60),在相应的癌旁正常组织中未见表达,克隆的NY-ESO-1 cDNA序列与GenBank报道一致。结论 NY-ESO-1基因在胃癌中呈高表达率,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-1类分子限制性CIL识别。     

福建地区汉族健康人群维生素D受体基因TaqI多态性分析

目的了解福建地区汉族健康人群维生素D受体（VDR）基因单核苷酸多态性位点分布特点。方法抽取福建地区汉族健康人79例,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应法（PCR-RFLP）测定VDR基因TaqI酶切位点多态性分布。结果 VDR基因TaqI酶切位点有两种基因型,TT、Tt两种基因型分布频率分别为81.01%、18.99%。T等位基因频率占90.51%,t等位基因频率占9.49%。基因型频率分布符合Hardy-weinberg平衡定律（χ^2=0.87,P〉0.05）,具有群体代表性。结论福建地区汉族健康人群VDR基因TaqI酶切位点多态性的分布与其他地区人群的分布,存在差异,可能为种族差异及环境因素的基因频率发生变化。     

Survivin基因在大肠癌中的表达及与端粒酶活性的关系

目的：探讨survivin基因在大肠癌中的表达及与端粒酶活性的关系。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和端区重复扩增法酶联免疫吸附测定(TRAP—ELISA)方法检测大肠癌及其癌旁组织survivin mR—NA表达和端粒酶活性情况。结果：(1)65％大肠癌组织表达survivin mRNA，而癌旁组织25％表达。Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移及分化程度无明显关系。(2)大肠癌组织端粒酶活性阳性率为90％，明显高于癌旁组织的5％，端粒酶表达阳性与大肠癌淋巴结转移、分化不良程度显著相关。(3)Survivin mRNA表达与端粒酶活性明显相关。结论：Survivin基因在大肠癌发生发展中可能起作用。端粒酶可作为诊断大肠癌的标志物。Survivin表达上调和端粒酶激活可能通过各自不同的信号途径在大肠癌变中发挥协同作用。