植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

人磷脂转移蛋白的原核表达及其抗体的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌表达人磷脂转移蛋白(PLTP),制备兔抗人PLTP的多克隆抗血清。方法采用RT-PCR技术,将人PLTP蛋白编码序列克隆入pET-30b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备PLTP抗血清。用间接ELISA法、Western blot、细胞免疫荧光检测对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果SDS-PAGE分析表明,PLTP基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为3h;将纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶256000;Western blot及细胞免疫荧光检测显示,抗血清可以与PLTP原核及真核表达蛋白特异结合。结论成功地将PLTP进行了原核表达,制备了高效价、高特异性的兔抗人PLTP抗血清,为PLTP的临床检测及其结构与功能的进一步研究提供了有力工具。     

氨基端PLCε基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

目的通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性。方法应用RT-PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε,并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达GST-PLCε融合蛋白,通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白,超滤后免疫家兔,获得家兔抗PLCε的抗血清。采用ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。结果 RT-PCR扩增出336 bp的PLCε基因,并成功构建重组质粒PGEX-6P-1/PLCε,质粒测序结果显示,目的基因序列与GenBank中PLCε基因序列完全一致。将纯化后的GST-PLCε蛋白免疫家兔,获得抗血清;ELISA效价1∶16 000以上;Western blot结果显示,该抗血清与原核表达的GST-PLCε融合蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。结论在原核细胞中表达了PLCε蛋白,制备了家兔抗人PLCε的抗血清,可用于相关肿瘤检测,为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础。     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的 原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S.构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NP-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(Mr).用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性.结果 双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其Mr约为66000.ELISA检测抗体效价高于1:25600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白.结论 成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体.     

大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的制备大鼠Toll样受体2胞外段(TLR2ex,405T-573Q)的多克隆抗体并鉴定其活性。方法用反转录PCR从大鼠肝细胞中扩增长507个碱基的TLR2部分胞外段,并构建重组表达载体p ET28a-TLR2ex。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2ex-6×His融合蛋白,该蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。ELISA鉴定抗血清的效价,Western blot法检测抗血清的特异性。结果成功构建了原核表达载体p ET28a-TLR2ex,并成功表达纯化了TLR2ex-6×His融合蛋白,将该蛋白免疫BALB/c小鼠后获得抗血清;Western blot法结果显示该血清可以特异性地检出E3大鼠脾组织TLR2蛋白,ELISA测定该多克隆抗体的效价可以达到1∶76 800。结论成功制备了大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)的多克隆抗体。     

Golph2蛋白质的原核表达及多克隆抗体制备

目的:新近发现Golph2蛋白与肝癌关系密切,制备Golph2重组蛋白质和多克隆抗体,建立Western blot检测技术,为后续研究提供基础.方法:RT-PCR从人肝癌细胞株WBF44钓取Golph2基因序列,PCR回复突变制备全长完整基因(1 206 bp),将其插入至原核表达载体pET-21、转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE鉴定.将纯化蛋白质免疫家兔,制备多克隆抗血清.建立Western blot 鉴定重组蛋白和抗血清特异性,测定临床血清标本中Golph2蛋白水平.结果:从肝癌细胞中钓取的基因,出现2个碱基置换突变和1个碱基缺失突变,经回复突变,获得与NM 177937完全一致序列.SDS-PAGE和Western blot证实,重组Golph2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白质和73 kD血清蛋白质.结论:Golph2蛋白质表达和抗血清制备完全成功,可以用于后续研究     

一种新的丝氨酸蛋白酶ESP30的表达及其多克隆抗体的制备

目的：在大肠杆菌中表达ESP30蛋白，并制备兔抗ESP30抗体。方法：从嗜水气单胞菌基因组中扩增ESP30基因序列，并克隆入非融合表达载体pDH2中，在温度诱导下，表达目的蛋白，以表达的ESP30作为免疫原免疫家兔制备抗ESP30抗血清，抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定。结果：在大肠杆菌中高效表达相对分子质量(Mr)约为66000的ESP30蛋白。ELISA法检测抗血清的效价可达到1：128000，Western blot分析抗血清可与原核表达的ESP30蛋白特异结合。结论：成功地制备兔抗ESP30的抗血清，为进一步研究ESP30蛋白的结构和功能奠定了基础。     

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.     

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备

目的 用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价.方法 利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清.结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带.对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合.结论 成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清.     

兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)多克隆抗体制备与应用

目的 制备兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)的多克隆抗体。方法 采用PCR点突变LDHC基因,并将该基因构建到pET-28a载体上,形成pET-28a-LDHC重组表达载体、将重组载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),诱导表达获得重组人LDHC4蛋白,将重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价,采用Western blot法检测抗血清的特异性,采用免疫组织化学法检测人三阴性乳腺癌组织中LDHC4的表达。结果 获得了特异性的兔抗人LDHC4多克隆抗体,抗体效价达1∶51 200,该抗体可用于Western blot法和免疫组织化学法。结论 成功制备了特异性兔抗人LDHC4多克隆抗体。     

猪新基因BCL-G_L的克隆与原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆猪的BCL-GL基因,进行原核表达,并制备出其多克隆抗体。方法:以提交NCBI的人的BCL-GL基因序列为种子序列,对猪的ESTs数据库进行比对拼接,得到contig序列。根据这个序列设计克隆引物,以猪脾脏总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR得到克隆序列。克隆序列经测序验证后,连接到原核表达载体pET-32a,构建成重组表达载体pET32a-BCL-GL,然后将重组载体转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达。经His-标签融合蛋白纯化试剂盒纯化得到纯化蛋白制备豚鼠多克隆抗体。结果:抗体ELISA效价为1∶800,Western blot反应特异性良好。结论:成功地克隆了猪BCL-GL基因,并进行了原核表达,制备了特异性豚鼠抗BCL-G血清,为进一步研究其功能奠定基础。     

人GALNT3-sol蛋白的原核表达和抗体制备

目的:构建人乙酰半乳糖胺转移酶3可溶性区域( GALfVI3-sol)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化GALN13 -sol蛋白,制备小鼠抗人GALIVI3-sol多克隆抗体,并对抗体的基本特性进行了检测.方法:RT-PCR扩增编码人GALIVI3 -sol的cDNA片段(1 755 bp),将其克隆至原核表达载体pET15b中,转化大肠杆菌B121( DE3)后,诱导表达人GALNr 13-aol重组蛋白.将变性、复性和电泳纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清.分别采用EL ISA和Westem blot检测抗体的效价和特异性.结果:成功构建了pET15b/CALArl3-so/原核表达载体,转BI21( DE3)后可高效表达重组蛋白GALIVI3-sol.获得的小鼠抗人GALN,l3_sol多克隆抗血清效价达1:25 600,并有良好的特异性.结论:成功获得人GALN'13-sol蛋白,得到了效价和特异性良好的小鼠抗人GALIVI3-sol抗体,为进一步研究人GALNT3在肿瘤组织中的表达提供了可靠的材料.     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备

目的：原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清.方法：参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签（EST）序列进行拼接,预测mlrp cDNA序列.用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体.以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用Western blot鉴定抗体的特异性.结果：预测的mlrp cDNA的长度为1 905 bp.将克隆获得的1 554 bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mLRP融合蛋白.以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清.结论：mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础.