脊髓来源神经干细胞分离培养及向雪旺氏细胞的诱导分化

目的 探讨新生大鼠脊髓来源神经干细胞(NSCs)的分离培养及在体外一定条件下向周围神经雪旺氏细胞分化的可行性. 方法 分离新生大鼠的脊髓组织,在含有B27(终浓度1%)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)(终浓度均为20 μg/L)培养基中分离培养出NSCs.用复合诱导因子(10%FBS+5 μmol/L血小板凝集抑制剂+10 ng/mL bFGF+5 ng/mE血小板源性生长因子)在体外诱导NSCs分化为雪旺氏细胞.免疫荧光细胞化学方法[一抗为p75、S-100、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)]鉴定体外诱导分化结果.结果 培养的新生大鼠脊髓组织细胞nestin染色表达阳性;分离培养的大鼠脊髓来源NSCs经诱导分化后形态类似雪旺氏细胞,免疫荧光细胞化学方法显示诱导后细胞表达雪旺氏细胞的表面标志,GFAP、S-100和P75表达阳性.结论 新生大鼠脊髓来源NSCs可以在体外诱导分化为雪旺氏细胞.     

胎鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养和鉴定：有向多种成体神经干细胞分化的潜能吗？*☆

背景：脑室周围白质软化是早产儿脑损伤的主要类型,迄今尚无防治方法。对丢失大量少突胶质细胞的白质进行神经干细胞移植,理论上应是治疗脑室周围白质软化最为理想的方案。 目的：体外培养制备具有多向分化潜能的胎鼠神经干细胞,以供后期实验经脑室移植应用。 方法：取孕12~14 d胎鼠大脑皮质组织,剪成1.0 mm3小块制备单细胞悬液分离纯化,待形成细胞球后加入含小牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化培养。观察神经干细胞的原代、传代培养情况,免疫组化法对神经干细胞分化情况进行鉴定。 结果与结论：培养的神经干细胞活力为(94.3±2.2)%,原代培养3 d形成神经球,体外传至10代左右,神经球的细胞团增殖速度明显减慢,部分细胞老化。各代神经球均呈巢蛋白染色阳性,可确认为神经干细胞。进一步对第4代神经球诱导分化培养后,免疫组化结果分别呈GFAP,β-tublin和O4阳性。提示所制备的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具备向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化的潜能。     

影响神经干细胞定向分化因素的研究进展

神经干细胞(NSC)具有自我更新和多分化潜能属性,可分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,这使得NSC移植替代神经系统疾病中丢失的细胞成为可能.NSC在胚胎和成体中枢神经系统均存在.NSC移植在体内环境下(尤其是非神经发生区域)绝大多数分化成胶质细胞(星形胶质细胞),有可能会加重胶质瘢痕形成.在中枢神经系统疾病的NSC细胞替代治疗策略中,NSC分化成合适的细胞类型显得格外重要.现就影响NSC定向分化的因素作一综述.     

神经干细胞诱导分化神经元培养方法的建立

目的:诱导大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元细胞系分化,建立体外培养神经元的模型。方法:从Wistar大鼠胚胎大脑分离、培养NSCs,小剂量碱性成纤维生长因子(bFGF)无血清条件培养基诱导NSCs定向分化,以免疫组化技术检测,与直接培养的海马细胞中NF200阳性细胞数以及神经元生长情况进行比较。结果:应用小剂量bFGF无血清培养基诱导NSCs定向分化7、10d,神经元生长良好,通过免疫组化检测到NF200阳性神经元数量多于直接培养的海马神经元(P<0.01)。结论:应用小剂量bFGF无血清条件培养基对NSCs进行定向诱导分化,培养的神经元生长良好,可作为体外神经元培养模型之一。     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键。 目的：以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成。 材料：清洁级新生2 d龄KM小鼠15只,孕16 d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供。 方法：采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5 d的星形胶质细胞条件培养液,-20 ℃冻存待用。体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108 L-1密度接种,设立2组：对照组单纯加入含体积分数0.1为胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率。 结果：培养的神经球细胞表达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。诱导分化7 d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平。实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组（t=35.296,P < 0.01）。 结论：在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化。     

大鼠脊髓源性神经干细胞的培养分化及其特异性研究

目的 研究大鼠脊髓源性神经干细胞培养和分化的特异性。方法 从孕17d的SD大鼠胚胎脊髓中分离，培养神经干细胞并用血清诱导其分化，通过免疫荧光化学方法研究其特性。结果 在血清的诱导下，脊髓源性神经干细胞大多数分化成GFAP阳性的星形胶质细胞，少数分化为tubulin-β阳性的神经细胞；与脑源性神经干细胞分化的神经细胞相比较，其分化出的神经细胞的突起长度明显延长。结论 脊髓源性神经干细胞在体外具有多向分化潜能，但与脑源性神经干细胞有明显差别。     

胚鼠室管膜及成鼠骨髓神经干细胞分离培养及分化鉴定实验研究

目的 :探寻胚鼠室管膜和成鼠骨髓分离培养神经干细胞 (NSC)的可行性。方法 :将分离的胚脑室管膜组织或成年骨髓细胞分别特殊培养。以细胞克隆及免疫细胞化学方法判断NSC增殖并鉴定NSC、神经元和神经胶质细胞。结果 :两种组织来源细胞在相应培养条件下NSC均有快速增殖。可得到具有长突起并建立有网状联系的神经元及胶质细胞。结论 :由胚鼠室管膜和成鼠骨髓诱导分化NSC是可行的     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究

目的探讨星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的影响。方法分离和培养新生大鼠脑组织的神经干细胞;采用差速贴壁法和振荡法分离纯化星形胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞,进行细胞的纯度鉴定;将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,免疫荧光法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果纯化的星形胶质细胞GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组(P<0·05)。结论星形胶质细胞源性因子可快速诱导神经干细胞向神经元细胞、包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生。     

人胚脊髓神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨人胚脊髓神经干细胞的体外培养和分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脊髓组织中分离培养出神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF和bFGF共同存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球,表达神经干细胞的标志物Nestin,经血清诱导后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞并表达特异性抗原NSE、GFAP和CNP。结论:在体外培养条件下可从人胚脊髓组织中培养出神经干细胞,它可为神经干细胞的基础研究和临床应用提供材料。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养及鉴定

背景：从胎鼠神经系统的多个部位如大脑半球、海马、皮质、脑室区等可分离出神经干细胞。 目的：探讨胚胎大鼠大脑纹状体神经干细胞的取材、分离、培养和鉴定方法,观察神经干细胞增殖、传代和分化的规律。 设计、时间及地点：观察性实验,于2008-03/08在烟台毓璜顶医院中心实验室完成。 材料：选用普通级健康成年Wistar大鼠12只,按雌雄1∶1比例于每晚6时合笼,次晨检查出阴道栓子(阴道内皮结晶)为妊娠0 d。 方法：在无菌条件下取孕13 d胚胎大鼠脑纹状体组织,用无血清培养技术在体外进行神经干细胞的培养、扩增和传代。分别用抗巢蛋白抗体、抗微管相关蛋白2抗体和抗胶质原纤维酸性蛋白抗体对培养的细胞进行干细胞特性和多分化潜能的免疫组织化学鉴定。 主要观察指标：①显微镜下观察细胞生长情况。②神经干细胞分化情况及免疫鉴定。 结果：①原代细胞种植后24 h可见大量分裂期的神经干细胞,呈对称或不对称分裂,细胞核较大,连续观察可见细胞分裂成2个完全独立的神经干细胞;48 h后出现许多由4~10个细胞疏松连接的细胞团;神经干细胞进入快速增殖期5 d后出现许多大小不等的细胞集落,即神经球,神经球呈规则的圆球状,细胞排列紧密,表面光滑没有突起。②培养4~6 h后悬浮的神经干细胞球逐渐贴壁,大部分细胞分化后胞体呈圆形或椭圆形,具有1个或2个长突起,少量细胞具有多个粗长突起。贴壁分化3 d左右,具有1个或2个突起的神经元样细胞逐渐减少,具有多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞逐渐增多。悬浮的神经干细胞球经巢蛋白染色呈阳性反应,部分细胞呈微管相关蛋白2和胶质原纤维酸性蛋白染色阳性。 结论：从胎鼠纹状体中分离培养的神经干细胞具有自我增殖、自我更新能力,并能分化为神经元及神经胶质细胞。     

Wistar大鼠胚胎脑源性神经干细胞分离、培养及其鉴定

目的 分离培养、鉴定Wistar大鼠胚胎脑源性神经干细胞.方法 从Wistar大鼠胚胎脑组织中分离胚胎脑源性神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代,应用免疫细胞化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果 分离培养获得大量悬浮生长的细胞团,该细胞具有连续增殖的能力,并能分化为神经元和神经胶质细胞,经传代培养8代后仍具干细胞特性.结论 Wistar大鼠胚胎脑组织中可成功分离培养神经干细胞,该细胞在体外适宜的条件下能够大量增殖,并具有多向分化潜能.

Abstract：

Objective To isolate and culture the brain-derived neural stem cells (NSCs) from Wistar rat embryos and identify the ability of proliferation and differentiation of NSCs. Methods The neural stem cells were obtained from the brain of Wistar rat embryos. They were cuhured and passaged with serum-free medium. Cultured and differentiated cells were identified with immunocytochemistry staining. Results Clusters of neural stem cells were obtained in suspension and these cells could be continuously proliferated. And the cells could be differentiated into neurons and astrocytes which maintaining the main characteristics of NSCs after 8 passages of culture. Conclusions The neural stem ceils derived from rat embryonic brains are able to proliferate and multiple potent for differentiation.     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。 目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。 方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。 结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈“S”型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠触须毛囊干细胞的分离培养和鉴定

背景：毛囊干细胞在体内膀胱及周围组织环境作用下有可能向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化,成为目前研究较新的干细胞之一。目的：建立一种高效简单的分离培养和鉴定毛囊干细胞的方法。方法：取大鼠触须部皮肤组织,体式显微镜下分离出毛囊组织,中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液“两步酶法”消化;所得细胞悬液中添加含体积分数10%胎牛血清的角质细胞无血清培养基,Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞,20 min以内贴壁的细胞作为实验组,未贴壁的细胞作为对照组;待筛选后的细胞生长至70%~80%汇合后,进行传代培养。结果与结论：筛选后的细胞形态均匀一致,折光性强,呈典型的“铺路石状”。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞仪检测实验组CD34和β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,对照组相应为(19.20±11.53)%和(63.57± 14.42)%,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明联用显微分离技术、二步酶法及差速贴壁法筛选可以获得纯度较高的毛囊干细胞。CD34和β1整合素表达是较理想的鉴定方法。     

经血源性子宫内膜间充质干细胞的分离、培养与鉴定*****

背景：目前用于干细胞研究的主要来源为胚胎干细胞和骨髓干细胞,但这两种来源都存在着部分局限性,因此需要寻找一种新型的干细胞以克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺乏及伦理学的争议等弊端。 目的：分离培养经血源性子宫内膜间充质干细胞并进行鉴定。 方法：采用Ficoll密度梯度离心法分离出人经血源性子宫内膜间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察;采用流式细胞仪对细胞表面抗原CD29、CD44、CD34 、CD45、HLA-ABC及HLA-DR进行表型鉴定;免疫细胞化学法测定经血源性子宫内膜间充质干细胞中nestin阳性细胞表达。 结果与结论：应用Ficoll密度梯度离心法可以从女性月经血中分离培养出干细胞,约2周原代细胞达到80%~90%融合,细胞呈漩涡状、网状、辐射状。传代后能稳定生长,可见纤维样细胞形态为主导。流式检测结果显示,经血源性子宫内膜间充质干细胞表现出CD29强阳性,CD44阳性,CD34 、CD45 、HLA-DR阴性,低表达HLA-ABC。染色显示nestin抗原在经血源性子宫内膜间充质干细胞中有表达,约占经血源性子宫内膜间充质干细胞的(10.35±0.51) %。结果表明经血源性子宫内膜间充质干细胞表达间充质干细胞的标记物,具低免疫源性;经血源性子宫内膜间充质干细胞表达nestin抗原,为经血源性子宫内膜间充质干细胞在神经系统应用提供一定的理论依据。     

脂肪间充质干细胞的分离培养和鉴定

背景：近年来的研究发现,在脂肪组织中也存在这与骨髓间充质干细胞类似的间充质干细胞。脂肪组织可以从美容吸脂中获得,来源丰富,取材方便,蕴藏着巨大的临床应用价值。 目的：分离培养人脂肪间充质干细胞并检测其生物学特性。 方法：用离心的方法获得人脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中行贴壁培养。并进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原。 结果与结论：采用消化、离心分离获得的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞仪检测表明超过90%细胞为CD29、CD45和CD105阳性。提示体外分离培养脂肪间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。