牛丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

目的　利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论 ,应用生物信息学技术和方法 ,克隆牛丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白结合蛋白 6 (HCBP6 )的同源基因。方法　首先应用酵母双杂交技术 ,以表达HCV核心蛋白的表达载体为诱饵 ,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选 ,首先获得人HCBP6的全长编码基因 ,然后应用美国国立生物信息学中心 (NCBI)建立的核苷酸序列数据库 (GenBank)的同源基因的检索 ,搜索与之同源的来源于牛的表达序列标签 (EST)。然后根据基因同源性的原则 ,确定牛HCBP6的同源基因。结果　获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的 36个基因片段 ,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索 ,获得了来源于牛的EST基因序列片段 ,最终确立了牛HCBP6的同源基因。结论　利用不同物种之间基因同源性的原理 ,NCBI数据库GenBank同源基因的搜索 ,获得了牛HCBP6同源基因。生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）相互作用蛋白的基因，明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3，将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体PGBKT7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人肝cDNA文库质粒PACT2的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基和X—α-半乳糖上进行双重筛选阳性菌落，提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上，选择生长菌落，提取质粒酶切鉴定，测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCV NS4A基因，构建表达载体并在酵母细胞中表达，与肝文库配合后选出既能在四缺培养基又能在铺有X—α-半乳糖的四缺培养基上生长，并变成蓝色的真阳性菌落22个，序列分析显示，筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞能量代谢、蛋白翻译合成等多种生物学过程。结论成功克隆出HCV NS4A蛋白在肝细胞内的结合蛋白，为进一步研究NS4A蛋白的功能、阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因，研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术，以HCV NS5A表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP9，在GenBank中注册，注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt)，编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成，并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆，为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6猴同源基因N的克隆化与序列分析

目的：利用酵母双杂交技术，业已成功克隆了人类丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的编码基因。为了阐明不同生物类型中HCBP6基因序列的同源性，阐明HCBP6的生物学功能，我们应用生物信息学技术，克隆猴HCBP6同源基因序列，并对其结构进行分析。方法：应用我们克隆的人HCBP6基因序列作为参照，对美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程信息中心(NCBI)建立的核苷酸数据库以及在线分析软件进行分析。对已经克隆的不同生物来源的HCBP6的同源基因序列进行比较。结果：猴HCBP6的同源基因开放读码框架长度为570bp，编码产物HCBP6蛋白由189aa组成。猴HCBP6的同源基因编码产物与人、猪、牛的HCBP6同源基因编码产物的同源性分别是96．27％、89．95％、85．7l％。结论：生物信息学技术是克隆不同生物类型的同源基因序列的可靠、快捷途径。猴HCBP6同源基因的克隆化为研究不同种属来源的HCBP6基因的结构域功能、表达与调控等研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵(microauray)技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因，阐明授性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVKDA反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苔酸序列分析证实正确无误。以PcDMA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总MA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5ATP13，在GenBank中登录，登录号为D21262。Ns5ATP13基因的编码序列全长为2103个核苷酸(nt)，编码产物由700个氨基酸残基(aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反式激活作用。微短阵技术是分析基因表达谱变化的自动化和高通量技术。应用这些技术，发现了HCVKDA反式激活作用的新的靶基因，将为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制及HCV相关疾病发病机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因2的克隆化研究

目的：对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)蛋白反式激活靶基因2(NS5A-TP2)的基因作克隆化研究。方法：依据我室构建的HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果，利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因NS5-ATP2的编码序列，对其氨基酸序列进行分析比较，并对其进行克隆化研究。结果：NS5A-TP2基因编码区为615核苷酸(nt)，编码产物为204氨基酸残基(aa)。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻，与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性，说明我们克隆的NS5A-TP2基因属于未知功能新基因。结论：发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为研究新基因的生物学功能及慢性丙型肝炎发病机制提供新的思路。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白3基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(Pre-S1)反式激活新型靶基因，进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-PreS1转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被前-S1蛋白反式激活，故命名为前-S1反式激活蛋白3(PSITP3)，已在GenBank中注册，注册号：AY446274。PSITP3基因的编码序列全长为1173个核苷酸(nt)，编码产物由390个氨基酸残基(aa)组成。结论HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用，最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用，上调宿主细胞某些基因的表达，从而改变宿主正常的免疫应答水平，引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现，为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法：应用噬菌体展示技术，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物构建克隆载体，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出10个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有：补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制，进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选与克隆白细胞中与NS5ATP7蛋白结合的蛋白编码基因

目的 应用酵母双杂交体系寻找与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 5 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus,NS5ATP7)相互作用的白细胞蛋白,以探讨SN5ATP7的生物功能。方法 应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP7诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒。DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果 筛选出15个与NS5ATP7特异性相互作用的克隆,其中包括人类RhoGDF分裂抑制剂α、人类细胞色素b558a亚单位、人类MLL(MLL)基因外显子、人类S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)、人类移动抑制因子相关蛋白14变体E(S100A9)、人类金属硫蛋白2A、人类染色体序列及人类cDNA序列等,1个是未知功能基因。结论 初步克隆了NSSATP7与白细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究NS5ATP7的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP7相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法：以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-pre-S1转染HepG2细胞．以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果：对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白2(PS1TP2),已在GenBank中注册,注册号：AY426673。PS1TP2基因的编码序列全长为573个核苷酸(nt),编码产物由190个氨基酸残基(aa)组成。结论：HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的免疫应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP4反式激活基因

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆NS5A-TP4反式激活相关基因，了解该基因的可能生物学功能。方法：以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3．1(-)-TP4转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照；制备转染后的细胞裂解液，从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA，经RSaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR)，将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果：成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到63个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因。结论：应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据。     

基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP2(615)蛋白反式调节基因

目的:对新基因NS5ATP2(615)转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我们研究组通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选得到的新基因NS5ATP2(615)的全长编码序列,构建NS5ATP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615).应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:确定基因NS5ATP2(615)由615nt组成,编码204aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5ATP2(615)表达质粒转染的细胞有40条差异表达基因,其中18条基因表达增强,22条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5ATP2(615)生物学功能及HCV NS5A的致病机制提供了理论依据.     

Resistance Patterns Associated with HCV NS5A Inhibitors Provide Limited Insight into Drug Binding

Direct-acting antivirals (DAAs) have significantly improved the treatment of infection with the hepatitis C virus. A promising class of novel antiviral agents targets the HCV NS5A protein. The high potency and broad genotypic coverage are favorable properties. NS5A inhibitors are currently assessed in advanced clinical trials in combination with viral polymerase inhibitors and/or viral protease inhibitors. However, the clinical use of NS5A inhibitors is also associated with new challenges. HCV variants with decreased susceptibility to these drugs can emerge and compromise therapy. In this review, we discuss resistance patterns in NS5A with focus prevalence and implications for inhibitor binding.     

应用抑制性消减杂交技术克隆筛选丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因.方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)-FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200～1000bp插入片断.挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据.     

中国人磷脂转运蛋白基因克隆及序列分析

为探讨中国人磷脂转运蛋白的基因结构、组成及特点 ,克隆了中国人磷脂转运蛋白基因。首先提取人胎肝组织总RNA ,以此为模板利用逆转录—聚合酶链反应法成功钓取了磷脂转运蛋白成熟肽基因片段 ,DNA序列分析所得基因片段由 14 2 8个碱基组成     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。