食管鳞癌雌激素受体α基因启动子甲基化异常

【摘要】目的：研究雌激素受体α(ERα)基因及启动子超甲基化与食管鳞癌的关系。方法：用RT-PCR法检测2个食管鳞癌细胞系ERα mRNA表达情况,甲基化特异PCR技术（MSP）检测ERα基因启动子超甲基化,对超甲基化的细胞用脱氧胞苷（5-aza-dc）去甲基化后检测细胞ERα mRNA。MSP检测47份组织ERα基因启动子超甲基化。结果：食管鳞癌细胞系存在 ERα基因启动子甲基化及其引起的ERα mRNA表达缺失。57.4% (27/47)的原发性食管鳞癌细胞有ERα基因启动子区的超甲基化,其中女性患者ERα启动子超甲基化检出率73.7% (14/19),明显高于男性(15/28,53.6%,P<0.05)。结论：ERα基因启动子超甲基化与食管鳞状上皮细胞癌相关。     

人肝细胞癌金属蛋白酶组织抑制因子-3的表达及与其基因启动子甲基化的关系

目的 探讨肝细胞癌的发生和门脉浸润机制。方法 20例肝细胞癌患者,每例在手术后分别取原发瘤、门脉瘤栓及远离肝癌之肝组织。用Western印迹法检测金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TIMP-3 mRNA的表达,用甲基化特异性PCR检测TIMP-3基因启动子的甲基化。结果 远离肝癌之肝组织中均可见TIMP-3蛋白和mRNA的表达,原发瘤和门脉瘤栓组织TIMP-3蛋白和mRNA表达明显降低,其中分别有5例和6例完全丢失。远离肝癌之肝组织均未发现TIMP-3启动子甲基化。原发瘤中有7例、门脉瘤栓组织中有9例出现甲基化。所有有甲基化的肝癌组织,包括原发瘤和门脉瘤栓,有13例TIMP-3 mRNA和蛋白表达完全丢失,6例表达降低。TIMP-3启动子甲基化和肝细胞癌组织学分级无关(P>0.05)。结论 肝细胞癌的发生和门脉浸润与TIMP-3基因和蛋白缺失或降低相关、而TIMP-3启动子甲基化是其基因和蛋白缺失或降低的原因。     

SMYD3过表达对人肝内胆管癌细胞miR-124表达及细胞增殖的影响

 目的：探讨肝内胆管癌细胞HCCC-9810中SET和MYND结构域含有蛋白3（SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3）过表达对miR-124表达及细胞增殖能力的影响。方法：瞬时转染 SMYD3 真核表达质粒后, Western blotting 检测细胞中SMYD3 蛋白水平的变化;qRT-PCR 检测细胞中SMYD3 mRNA 和miR-124 表达;甲基化特异性PCR检测miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化水平;CCK-8 和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果：以空白组为对照,肝内胆管癌细胞HCCC-9810在转染pEGFP-SMYD3质粒后,SMYD3蛋白及 mRNA 表达均显著上升（P＜0.05）,miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化显著增加（P＜0.05）,miR-124表达明显下降（P＜0.05）,细胞增殖能力显著提高（P＜0.05）。结论：过表达 SMYD3可引起miR-124基因启动子甲基化增加,导致胆管癌细胞中miR-124 的表达下降,同时过表达SMYD3可增强细胞增殖能力。     

肝细胞癌抗原587基因甲基化调节HCA587-TAF9互作介导肝细胞癌的侵袭和迁移

目的：研究肝细胞癌抗原587（HCA587）在肝细胞癌（HCC）组织中的表达和启动子区甲基化状态,探 讨HCA587对肝细胞癌细胞迁移和侵袭的调节机制。方法：纳入肝细胞癌肿瘤组织114 例,分为HCC组和癌旁 非癌组织（NT）组。荧光定量PCR 检测HCA587的mRNA表达量;免疫组织化学和免疫印迹检测HCC组和NT 组组织中HCA587的蛋白表达。基于甲基化敏感酶和甲基化依赖酶酶切,并结合荧光定量PCR 方法分析肝细胞 癌组织中HCA587基因启动子区甲基化状态。构建重组HCA587过表达质粒（pcDNA3.1-HCA587）,培养人肝 细胞癌细胞系BEL-7404,转染pcDNA3.1-HCA587 或者使用甲基化抑制剂5-Azacytidin 处理细胞。细胞分为对照 组、5-Azacytidin 组、pcDNA3.1-HCA587 组和pcDNA3.1-HCA587 空载体（EV） 组。免疫沉淀法分析HCA587 与TATA 盒结合蛋白相关因子9（TAF9）的结合,Transwell 小室检测细胞的迁移和侵袭能力。结果： 与癌旁非 癌组织组比,HCC组的HCA587在mRNA和蛋白水平均上调。免疫组织化学证实HCC组组织中HCA587阳性表 达。HCC组中HCA587的启动子区CpG 岛甲基化水平降低。体外实验结果显示,5-Azacytidin 促进BEL-7404 中 HCA587的表达、HCA587与TAF9的结合、BEL-7404 细胞的迁移和侵袭能力,但抑制HCA587甲基化水平;另外, HCA587过表达增强BEL-7404 细胞的迁移和侵袭能力。结论：HCA587高表达或抑制其启动子区甲基化可以促进 HCA587与TAF9的结合及导致肝细胞癌细胞的迁移和侵袭。     

小檗碱抑制高转移性人巨细胞肺癌PG细胞侵袭和迁移的研究

目的：研究小檗碱对高转移性人巨细胞肺癌PG细胞侵袭和迁移的作用并探讨其作用机制。方法：小檗碱（5mg／L、10mg／L）处理PG细胞24h，采用琼脂糖滴法观察PG细胞的运动能力，用下室加FN的Transwell小室法观察PC．细胞的趋化运动能力，用铺Martrigel的Transwell小室观察PG细胞的侵袭能力。通过SABC免疫细胞化学法及图像分析软件，半定量PG细胞MMP-2、TIMP-2的表达；RT-PCR法检测PG细胞MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA的表达。     

食管鳞癌分泌素-3A1基因启动子甲基化异常

[目的]研究具有抗癌活性的细胞因子分泌素-3A1基因启动子超甲基化所至该基因表达抑制在我国食管鳞癌发生中的作用。[方法] 用RT-PCR 方法检测分泌素-3A1基因在12个食管鳞癌细胞系的表达,并用甲基化特异PCR技术（methylation specific PCR, MSP）检测上述细胞系及37例来自我国河南的原发性食管鳞癌标本分泌素-3A1基因启动子甲基化状态,通过5-aza-dc处理使培养细胞去甲基化,RT-PCR技术检测处理后该基因在Kyse30的重新表达。[结果] 该基因仅在Kyse410、Kyes520和TE8等3个细胞系有表达,5-aza-dc处理可使Kyse30重新表达分泌素-3A1。此外,在18/37（48%）例原发性食管鳞癌细胞有分泌素-3A1基因启动子区域的超甲基化。[结论] 启动子超甲基化造成分泌素-3A1基因在上述食管鳞癌细胞系表达抑制,原发性食管鳞癌细胞分泌素-3A1基因启动子超甲基化提示该基因表达抑制可能与食管鳞癌发生有关。     

急性白血病细胞系中SFRP基因启动子甲基化及去甲基化诱导表达的研究

 目的：探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）基因家族启动子CpG岛异常甲基化状态与急性白血病（AL）发生发展的关系,以及DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷酸（5-Aza-CdR）去甲基化诱导SFRP基因表达作用的可能机制。方法：采用甲基化特异性PCR检测不同AL细胞系（Molt-4、Jurkat、HL-60和NB4）和不同浓度5-Aza-CdR作用下Jurkat细胞系中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因启动子区的甲基化状态,采用实时荧光定量RT-PCR检测SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表达,采用半定量RT-PCR检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达。结果：在正常人细胞中不存在SFRP基因的甲基化。SFRP1、SFRP2和SFRP5基因在HL-60、NB4、Molt-4和Jurkat细胞系中均呈完全甲基化状态;SFRP4基因在NB4、Molt-4和Jurkat细胞系中完全甲基化,在HL-60细胞系中则部分甲基化。5-Aza-CdR可逆转SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的高甲基化状态,并能够下调DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平,诱导SFRP基因恢复表达。结论：在AL细胞系中,SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因出现高甲基化,与AL的发生密切相关,可能成为AL新的基因标志物。5-Aza-CdR通过抑制DNMT表达,逆转SFRP基因的甲基化状态,恢复其表达。     

TIMP-3基因甲基化与结直肠癌临床病理的关系

目的：探讨TIMP-3基因甲基化与结直肠癌临床病理指标和转移复发的关系。 方法： 采用巢式甲基化特异性PCR技术（nMSP法）检测100例结直肠癌组织和100例癌旁非癌组织TIMP-3基因甲基化；采用RT-PCR检测100例结直肠癌组织和100例癌旁非癌组织TIMP-3 mRNA的表达。 结果： 肿瘤组织TIMP-3 mRNA的表达阳性率为64%，肿瘤组织TIMP-3 mRNA的表达率明显低于癌旁非癌组织（P＜0.01）；TIMP-3 mRNA的表达率无淋巴结转移组（34/42）高于淋巴结转移组（30/58）（P＜0.01），甲基化阳性率Duke’s C+D期伴淋巴结转移组明显高于Duke’s A+B期不伴淋巴结转移组（P＜0.05）。结肠近端、分化程度差的结直肠癌组织甲基化阳性率明显高于远端直肠和分化程度高者（P＜0.05）。 结论： TIMP-3基因甲基化容易发生在结肠近端、Duke’s C、D期、伴淋巴结转移、细胞分化差和浸润型结直肠癌患者。     

5-aza-2dC诱导白血病细胞分化及对Annexin A1/A2表达和甲基化状态的影响

目的：观察甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycitydine, 5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞系HL-60细胞分化及对膜联蛋白A1/A2(Annexin A1/A2)表达和甲基化状态的影响。 方法：瑞氏染色和流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞分化的影响；RT-PCR法检测药物处理HL-60细胞前后Annexin A1和A2基因mRNA的表达水平；甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测药物处理HL-60细胞前后Annexin A1和A2基因启动子区域CpG岛的甲基化水平。 结果：5-aza-2dC处理后HL-60细胞的髓系分化抗原CD11b的表达增强，细胞向成熟分化，且在0.5 μmol/L时其促分化作用最明显；Annexin A1和A2基因在HL-60细胞中低表达，0.5 μmol/L 5-aza-2dC处理HL-60细胞72 h后，Annexin A1和A2基因mRNA表达水平明显上调，而其启动子区域CpG岛甲基化水平明显降低。结论：5-aza-2dC具有促进白血病细胞分化的作用，Annexin A1和A2基因启动子去甲基化可能与5-aza-2dC诱导白血病细胞分化有关。     

乳腺癌中印记基因SLC22A18/TSSC5/BWR1A启动子区甲基化及mRNA表达的研究

目的： 研究印记基因SLC22A18启动子区甲基化对乳腺侵润性导管癌组织中的SLC22A18 mRNA表达的影响，探讨其与临床病理特征之间的关系。方法：实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative RT-PCR）方法检测40例乳腺侵润性导管癌及其癌旁组织中SLC22A18 mRNA的表达，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SLC22A18基因启动子区的甲基化状态。检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231后，对SLC22A18基因启动子区DNA甲基化和mRNA表达的影响。结果：SLC22A18在40例乳腺侵润性导管癌中mRNA表达量低于癌旁组织（0.12±0.10 vs 0.69±1.05，P＜0.01）；40例乳腺侵润性导管癌及对应癌旁组织中，SLC22A18启动子区的甲基化发生率分别为75％和37.5%，差异有统计学意义（P＜0.01）；在40例乳腺侵润性导管癌组织中，甲基化组SLC22A18 mRNA表达量低于非甲基化组（0.11±0.08 vs 0.24±0.18，P＜0.01）。5-aza-dc和5-aza-dc/TSA能不同程度逆转乳腺癌细胞株MDA-MB-231中SLC22A18基因的甲基化状态，并上调SLC22A18基因表达。结论：SLC22A18基因甲基化与乳腺癌发生有一定的关联，SLC22A18基因表达下调与其启动子区CpG岛异常甲基化相关。     

SFRP5基因甲基化通过激活Wnt/β-catenin通路调节白血病细胞MDR1/P-gp的表达

 目的:研究分泌型卷曲相关蛋白5（SFRP5）基因甲基化对耐药白血病细胞多药耐药蛋白1/P-糖蛋白（MDR1/P-gp）表达的调节及其可能的信号通路。方法:采用甲基化特异性PCR（MSP）检测白血病患者及白血病细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态。采用Western blotting检测非磷酸化β-catenin（NP-β-catenin）在SFRP5基因甲基化白血病患者及细胞系中表达。使用去甲基化试剂5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶（DAC）恢复SFRP5表达,采用RT-PCR和real-time PCR检测处理前后MDR1 mRNA表达,采用Western blotting检测P-gp表达。结果:5/12例白血病患者标本及4种白血病细胞系存在SFRP5基因完全甲基化。在5例患者标本中,有3例（L2、L7和L8）NP-β-catenin水平高于其它标本,在4种白血病细胞系中,KG1a中NP-β-catenin水平高于另外3个细胞系。存在NP-β-catenin高水平表达的3例患者（L2、L7和L8）中检出MDR1 mRNA及P-gp表达。在4种细胞系中,KG1a存在MDR1 mRNA及P-gp表达。使用去甲基化试剂DAC处理L2、L7、L8患者标本和KG1a细胞,恢复SFRP5表达,L2、L7、L8和KG1a中MDR1 mRNA水平均显著下降（P<0.01）,P-gp表达水平亦被下调。结论: SFRP5基因甲基化可导致Wnt/β-catenin信号通路被激活,活化的β-catenin激活下游靶基因MDR1转录,编码的药物外排泵P-gp表达增加,促进白血病多药耐药的形成。     

启动子甲基化调控NK-92MI细胞KIR3DL1基因表达

目的:观察NK细胞系NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化模式及去甲基化和组蛋白乙酰化对基因表达的影响,探讨KIR3DL1基因的表达调控机制.方法:采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷和(或)组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂曲古抑菌素A处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化和组蛋白乙酰化,观察启动子区CpG岛甲基化和组蛋白乙酰化与KIR3DL1基因表达的关系.结果:NK-92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区高甲基化,CpG二核苷酸甲基化频率在70%～100%之间;应用终浓度为2.5 μmol/L和5 μmol/L的5-氮胞苷作用72 h可以诱导NK-92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量分别增加66.6%和114.6%;单用终浓度为50 nmol/L的曲古抑菌素A不能诱导NK-92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量增加;此外,曲古抑菌素A和5-氮胞苷联用与单用5-氮胞苷相比也没有协同作用.结论:NK-92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控.     

Effect of 5-azacytidine (5-aza) on UCP2 expression in human liver and colon cancer cells

The function of the uncoupling protein 2 (UCP2) is different for each cancer cell. However, the mechanism of expression is still unclear. DNA methylation affects protein expression and is one factor that transforms normal cells into cancer cells. In this study, the hepatocellular carcinoma Hep3B and HepG2 cells and colorectal cancer HT-29 cells were treated with 5-azacytidine (5-aza), a DNA demethylation agent, to observe the modification of UCP2 expression and the methylation degree in the UCP2 promoter region. Promoter basal activity and degree of UCP2 expression were measured in Hep3B, HepG2, and HT-29 cells. In addition, methylation-specific PCR (MSP) was performed to investigate the degree of methylation in the UCP2 promoter region. The methylation region in the UCP2 promoter was confirmed based on bisulfite sequencing. In Hep3B cells in which UCP2 mRNA was not transcribed, the promoter basal activity was significantly higher than in HT-29 or HepG2 cells in which UCP2 mRNA was transcribed. Treatment with 5-aza increased UCP2 expression in Hep3B and HT-29 cells; however, the expression in HepG2 cells was unchanged. The UCP2 promoter in Hep3B cells has numerous methylated regions compared with HT-29 and HepG2 cells. The results of the present study revealed that inhibition of UCP2 expression in Hep3B cells was due to methylation of the promoter region. Investigating the mechanism that induces UCP2 expression in cancer cells is important to understand the function of UCP2, which could aid in cancer treatment.     

5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响

目的 观察人结肠癌Caco-2细胞系P16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导高甲基化失活的P16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响.方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞系,MSP法检测用药前后P16基因的甲基化状态,RT-PCR方法检测P...     

Methylation of PRDM2, PRDM5 and PRDM16 genes in lung cancer cells

Aims: To investigate the changes of expression and methylation status of PRDM2, PRDM5, PRDM16 in lung cancer cells after treatment with demethylation agent. Methods: A549 (lung adenocarcinoma cell line), HTB-182 (lung squamous cell carcinoma cell line) and HBE (normal bronchial cell line) were treated with 5-aza-2dC. The methylation state of PRDM2, PRDM5, PRDM16 was detected by MSP. The expression of PRDM2, PRDM5, PRDM16 was detected by RT-PCR and Western blot analysis. Cell growth was detected by MTT assay. Results: 5-aza-2-dC reduced the methylation of PRDM2, PRDM5, PRDM16 gene in A549 and HTB-182 cells but not in HBE cells. Consistently, 5-aza-2dC increased mRNA and protein expression of PRDM2, PRDM5, PRDM16 in A549 and HTB-182 cells but not in HBE cells. Furthermore, 5-aza-2dC inhibited the growth of A549 and HTB-182 cells but not HBE cells. Conclusions: PRDM2, PRDM5, PRDM16 promoters are methylated and their expression is suppressed in lung cancer cells. Demethylation drug 5-aza-2dC could upregulate the expression of PRDM2, PRDM5, PRDM16 and suppress lung cancer cell growth. 5-aza-2dC has potential to be used for lung cancer therapy by epigenetic mechanism.