旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫相对分子质量（Mr）21 000抗原基因（Ts21）并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。 方法 将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X，构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21，经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清，ELISA检测抗体滴度，免疫荧光检测（IFA）确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。 结果 SDS-PAGE结果显示，表达产物为Mr 63 500的重组融合蛋白，IPTG诱导4 h后表达量最大，薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别，但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别；与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应，但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体，IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。 结论 成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性。     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

旋毛虫重组35.5ku蛋白免疫诊断价值的研究

目的研究旋毛虫重组35.5ku蛋白的免疫诊断价值。方法通过RT-PCR扩增旋毛虫35.5ku蛋白基因TspSP-1.2,构建重组质粒pUC18-TspSP-1.2,测序正确后亚克隆至表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达载体pET-30a(+)-TspSP-1.2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的抗原性。结果构建的重组表达载体pET-30a(+)-TspSP-1.2能够表达旋毛虫35.5ku蛋白,该重组蛋白可被旋毛虫感染小鼠血清、旋毛虫ES抗原免疫鼠血清及旋毛虫患者血清识别,与日本血吸虫、并殖吸虫、华支睾吸虫患者及正常人血清均无交叉反应,但与猪囊尾蚴患者血清有交叉反应。结论旋毛虫重组35.5ku蛋白可作为旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的　对旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。　方法　利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET-28a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3 ),以异丙基-β-D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Western blotting)分析表达产物。　结果　 SDS-PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 48000 ,与理论值相符。ELISA和Western blotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 46000蛋白。　结论　成功表达了旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定北大核心CSCD

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴Ts3基因的克隆表达及编码蛋白的结构预测

目的寻找猪囊尾蚴病诊断抗原候选分子基因。方法用猪囊尾蚴病患者血清免疫筛选cDNA文库,用生物学软件EXPASY预测分析所获阳性蛋白基因(Ts3)及其编码蛋白的理化性质。对Ts3基因进行克隆,构建原核表达载体pET28a(+)-Ts3,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析观察其表达情况。结果获得大小为531bp的含完整阅读框(ORF)DNA序列的基因Ts3(GenBank登录号为EU338456),预测分析该蛋白结构和理化性质比较稳定,为非跨膜蛋白和含有较多蛋白激酶C磷酸化位点;将Ts3基因克隆入载体pET28a(+)诱导表达,获得相对分子质量(Mr)约21000蛋白,并能被囊尾蚴病患者血清识别。结论囊尾蚴Ts3重组蛋白具有免疫反应性。     

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　观察编码旋毛虫相对分子质量(Mr)31000抗原的DNA疫苗(重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。　方法　通过用阳离子脂质体Lipofectamine2000将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞,G418筛选阳性克隆,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、间接荧光抗体试验(IFAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)对表达产物进行鉴定。　结果　RT PCR结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在876bp处有一条带,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约31000的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。　结论　重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫     

旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的　克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。　 方法　大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。　 结果　SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。　结论　旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的　在体外真核细胞 COS7中表达重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87,为旋毛虫病 DNA疫苗的研究奠定基础。　方法　将重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87经脂质体 L ipofectamine介导 ,体外转染真核细胞 COS7,通过细胞免疫组化 ,细胞裂解物的 SDS- PAGE电泳和 Western- blot分析检测表达产物。　结果　重组质粒能够在 COS7中表达出约 38ku的目的蛋白 ,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。　结论　构建的重组质粒可在体外真核细胞 COS7中成功表达。     

旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的对旋毛虫新生幼虫期特异性T668cDNA进行表达及鉴定,以获得基因工程抗原。方法应用PCR技术,从pBK CMV T668重组质粒中扩增到不含信号肽序列的T668cDNA片段,将目的基因克隆于原核表达载体pET28a(+),构建pETT668重组质粒,再将其转化到E.coli表达菌株DE3感受态细胞中,经IPTG诱导表达,以SDS PAGE鉴定表达产物。结果pETT668表达蛋白的分子质量单位为49ku,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加,诱导5h时表达量达到高峰;薄层扫描结果显示,目的蛋白占菌体总蛋白的34.6%。Western blotting检测显示,表达蛋白可被感染旋毛虫家猪血清所识别。结论旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在大肠埃希菌中获得高效表达,且表达蛋白具有良好的抗原性。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。