PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

食物中毒中副溶血性弧菌和沙门菌双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立双重荧光PCR用于检测食物中毒中副溶血性弧菌和沙门菌。方法设计特异性引物和探针用于扩增副溶血性弧菌tlh基因和沙门菌invA基因(invA),采用倍比稀释法检测方法的DNA灵敏度和菌液灵敏度,采用9株其他肠道致病菌验证方法的特异性。结果两种病原菌DNA检测灵敏度分别为65 fg/PCR和56 fg/PCR体系,菌液检测灵敏度分别为11 cfu/ml和9 cfu/ml,特异度100%。用建立的方法对4起食物中毒进行检测,共检出副溶血性弧菌15株和沙门菌8株。结论该方法高效并具有很高的灵敏性和特异性,在副溶血性弧菌和沙门菌引起的食物中毒的快速检测中具有广阔的应用前景。     

水体污染中常见致病菌的多重PCR分子检测研究

[目的]建立同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌和副溶血弧菌等5种水体常见致病菌的多重PCR检测技术,为这些致病菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]筛选设计5对特异引物,建立优化的多重PCR扩增体系和条件。[结果]对5种致病菌的检测,多重PCR灵敏度分别为：肠出血型大肠杆菌O157102 cfu、志贺氏菌102 cfu、副溶血弧菌102 cfu、绿脓杆菌101 cfu、沙门氏菌102 cfu。应用于人工污染水样及天然水样的检测,均有清晰、特异的预期条带产生,并与传统检测结果一致,每个样品所需时间为6～8 h,相对于传统检测方法,极大地缩短了检测时间,提高了检测灵敏度。[结论]该方法适用于大通量样品的检测研究,可推广应用于食品检测、环境监测等领域。     

利用多重PCR检测食品中副溶血性弧菌的方法研究

目的:建立食品中副溶血性弧菌的简便、快速、准确地检测方法。方法:根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计引物,多重PCR扩增,进行特异性和标准菌株的验证,并用经典方法做平行试验。结果:本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269、500 bp的片断,而对其它种类的菌无特异性扩增。结论:本实验方法可在增菌后8 h快速、简单、准确的检测出食品中的副溶血性弧菌,灵敏度可达15 cfu/ml。     

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因

目的建立同时检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的双重荧光PCR方法。方法筛选副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因的特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度实验,并对本实验室保存的54株副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因的检测,以了解不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因的状况。结果建立的双重荧光PCR方法特异度强(100%),最低检测浓度达到20 cfu/ml,对本实验室保存的副溶血性弧菌进行毒力基因的检测结果显示,从临床分离的10株副溶血性弧菌和海产品样品中分离的1株副溶血性弧菌均为tdh扩增阳性,trh扩增阴性。结论所建立的方法特异性好,灵敏度高,适用于副溶血性弧菌的毒力基因检测。     

三种食源性致病菌多重PCR检测技术建立及应用研究

目的建立多重PCR方法同时检测水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌。方法分别以沙门菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和单核细胞增生性李斯特菌iap基因为靶基因,建立并优化了同时检测水产品中这3种致病菌的多重PCR体系,扩增产物分别为495bp(invA)、368bp(toxR)和660bp(iap)。结果建立的多重PCR方法可以简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌的同时检测,人工污染水产品检测限为10cfu/ml。结论为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段,有良好的应用前景。     

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的 建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法. 方法 根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测.同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度. 结果 本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml.并进行了肛门拭子样品的检测. 结论 初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术.     

副溶血性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)检测副溶血性弧菌的方法,并了解该菌携带毒力基因的情况。方法:根据副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh和种特异性基因toxR进行引物设计,以其单一PCR扩增产物在DHPLC出现的色谱峰作为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC的检测方法。结果:该方法能有效扩增副溶血性弧菌的tdh、trh和toxR基因,25株副溶血性弧菌的MPCR扩增产物经DHPLC分析所得的色谱峰在位置和峰型与标准色谱峰有很好的符合性,其他菌属的菌株均无特异性扩增,对模拟污染样品可正确检测,灵敏度达到1*103CFU/ml,特异性达到100%。结论:本文建立的MPCR-DHPLC方法可准确检测副溶血性弧菌,并了解该菌携带毒力基因的情况。     

食品中副溶血弧菌荧光定量PCR方法快速检测

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中副溶血弧菌污染的快速、准确的定量检测方法。方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列设计合成副溶血弧菌FQ-PCR诊断试剂盒，研究其灵敏度、特异性，并应用于模拟食品样本检测。结果在31株不同菌株的检测中，8株副溶血弧菌结果均为阳性，而其他23株弧菌科及其他菌属的菌株均为阴性；纯菌条件下定量检测低限10cfu／ml；对模拟样本直接进行，检测低限为10^3cfu／g，经培养增菌后，检测低限则达到2cfu／g。结论该方法特异性强、敏感性高，操作简便快速，检验周期仅需36h，扩增与检测在封闭单管进行，可避免常规PCR方法易污染缺陷，具有很好的推广应用前景。     

提高贝类海鲜中副溶血性弧菌PCR快速检测方法灵敏度的研究

[目的]提高贝类海鲜中副溶血型弧菌PCR快速检测方法灵敏度。[方法]选取副溶血性弧菌的属特异性tl基因设计引物,对PCR反应体系进行优化,20μl体系中加入了20μg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)。[结果]13株不同来源的副溶血性弧菌均扩增出450bp条带,纯培养菌液的检出限低至4×103cfu/ml,污染样品的检出限低至4cfu/g。[结论]适量的牛血清白蛋白浓度可显著提高检测方法的灵敏度。     

多重PCR同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因的研究

目的建立一种多重PCR方法,在同一扩增体系内同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因,探讨采用多重PCR同时检测淋菌及其耐药基因的可行性. 方法根据淋菌CPPB、TeM-1、Tet-M基因序列,分别设计了3对引物,并在同一扩增体系内行PCR扩增,扩增的靶序列分别为150 bp、224 bp、316 bp. 结果淋菌及其青霉素、四环素耐药的标准菌株,上述3个基因位点的检测均为阳性,对125例临床标本同时进行传统培养、药敏和多重PCR检测,结果显示淋菌的检出率:培养法为20.0%,PCR法为24.8%;PPNG检出率:药敏法为16.0%,PCR法为20.8;TRNG检出率:药敏法为14.4%,PCR法为19.2%. 结论该法与传统的培养及药敏试验相比具敏感、特异、迅速、标本不受淋菌存活以及药敏试验诸多因素的影响,是一种简便、快速、可靠的方法.     

应用PCR技术检测致病性钩端螺旋体

目的 建立一种能特异检测我国致病性钩端螺旋体所有血清型的PCR方法。方法 从Genbank中选取钩体23SrDNA序列，设计一对种特异性引物。通过Blast验证引物的特异性和广谱性后，用PCR检测我国流行的所有18个血清群钩体代表株，观察其敏感性和特异性。探讨简便的样品处理方法，并对模拟标本进行检测。结果 18个血清群的25株钩体均出现单一482bp的特异性扩增产物，而双曲钩体及其他螺旋体、微生物、空白对照均无任何DNA扩增条带。PCR单一反应最小检出钩体数为8条。用煮沸法、试剂盒、SiO高盐吸附法及氯仿苯酚混合法处理样品对PCR结果无明显影响。对模拟标本的检测符合临床实际要求。结论 PCR方法是一种灵敏度高、特异性强、检测谱广的快速检测钩体的有效方法。     

DNA扩增制备探针并用于临床白色念珠菌感染鉴定

目的应用聚合酶链反应技术扩增特异DNA片段,并制备成为可应用于临床鉴定白色念珠菌的基因探针. 方法采用聚合酶链反应技术特异地扩增白色念珠菌标准株DNA EO3 125 bp基因片段,然后用半抗原地高辛配基标记,在完成基因探针显色敏感度检测之后,应用该基因探针分别对血液病病房分离的白色念珠菌、热带念珠菌及大肠埃希菌等多种细菌进行斑点杂交测试. 结果基因扩增制备Dig-125 bp DNA探针显色敏感度为0.01 pg,具有白色念珠菌特异性,与其他念珠菌和细菌不发生杂交. 结论基因扩增制备EO3 125 bp DNA探针方法简便可靠,具有很强特异性,可应用于临床鉴定白色念珠菌感染.     

X-连锁慢性肉芽肿病的植入前遗传学诊断方法学研究

目的:采用多重置换扩增(MDA)建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断(PGD)方法,可应用于X-连锁慢性肉芽肿病的PGD。方法:采用16个位于CYBB基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-连锁慢性肉芽肿病家系进行单体型分析,采用MDA对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及特异性扩增CYBB基因进行分析,同时采用位点Amel进行性别诊断。结果:家系分析结果显示共有7个STR位点具有多态性。共进行了10个单淋巴细胞及10个单卵裂球的MDA,全部扩增成功。对致病基因CYBB外显子8的聚合酶链反应(PCR)扩增效率为100%,其中1个单淋巴细胞发生致病位点的等位基因脱扣(ADO),10个单卵裂球诊断结果均为215 bp,未检测出异常的204 bp条带,ADO率为10%(1/10);对于7个有多态性的STR位点和位点Amel,PCR扩增效率为96.9%(155/160),ADO率为11.3%(13/115)。结论:采用MDA结合致病基因特异性扩增及单体型分析在单细胞水平对X-连锁慢性肉芽肿病进行检测,两者相结合可避免污染、ADO等导致的误诊,可提高PGD的诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础。     

3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

目的:建立快速检测食源性致病菌的多重PCR方法。方法:本研究根据肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)的大肠杆菌不耐热毒素(Heat labileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),分别设计了三对引物,预计PCR扩增的目的基因片段为194、279和435 bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测肠毒性大肠埃希菌、伤寒沙门菌和福氏志贺菌的稳定的单管多重PCR方法。结果:该方法检测的灵敏度分别为:145 pg/ml肠毒性大肠埃希菌的基因组DNA、100 ng/ml伤寒沙门菌的基因组DNA、7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA,与单基因PCR检测的灵敏度相同。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。结论:该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控。     

应用多重PCR快速检测空肠弯曲菌

目的:建立能快速、特异检测空肠弯曲菌的多重PCR技术。方法:选用针对空肠弯曲菌外膜蛋白A(mapA)基因和马尿酸酶(hipO)基因的2对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了鸡肉模拟样品检测。结果:该方法扩增目的基因片段分别为589 bp和323 bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为105 cfu/ml,鸡肉模拟样品42℃预增菌36 h后检测灵敏度能达到101 cfu/ml。结论:初步建立能快速、灵敏、特异地测定空肠弯曲菌的多重PCR检测技术。     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。     

Footrot on a sheep breeding farm in the Himalayan state of Jammu and Kashmir

In the present study ovine footrot was detected clinically on a sheep farm in the Himalayan state of Jammu and Kashmir. Dichelobacter nodosus was confirmed by culture and polymerase chain reaction (PCR) using species-specific 16S ribosomal RNA primers. When cultured, the organism appeared as flat colourless colonies having a fine granulated structure with irregular margins, and showing characteristic Gram-negative rods with swollen ends. Detection by PCR from cultured bacteria resulted in amplification of a 783 base pairs (bp) product. Serogrouping by multiplex PCR using group (A-I)-specific primers revealed the presence of serogroup B-specific bands of 283 bp.     

雌激素受体基因多态性与子宫内膜异位症关联研究

目的: 通过对雌激素受体基因多态性与子宫内膜异位症 (EM) 关系的研究, 明确遗传因素对EM的影响, 从分子遗传学的角度探讨EM的发病机制、早期诊断指标及方法。方法: 取 49名病理确诊为子宫内膜异位症的患者为EM组, 50名月经正常, 生育过正常小孩, 查无乳腺癌及妇科肿瘤, 在该院腹腔镜下或开腹做输卵管结扎或输卵管吻合术等, 排除EM、腺肌症的女性作为正常对照组。每位妇女取静脉血 2ml, 用酚 氯仿法提取和纯化DNA, 用设计雌激素受体 (ER) 基因类扩增ER基因 1号内含子及部分 2号外显子之间一段靶DNA引物, PCR变性、退火和延伸条件分别为 94℃30s、60℃40s、72℃90s,共 35个循环。PCR扩增产物用 1 5%agarose电泳检查扩增结果, 扩增产物大小为 1 3kb。PCR扩增后分别取 15UPvuⅡ与 10UXbaI内切酶于 37℃酶切至少 3h, 酶切产物经 1 5%琼脂糖溴乙锭电泳分离, 紫外灯下判断结果。结果: 标本经酶切后可产生 3种酶切格局: 使用PvuⅡ酶切可区分出 3种基因型: PP型 (终产物为一 1 3kb大小的条带), Pp型 (终产物为 1 .3kb、850bp、450bp大小的 3条带), pp型 (终产物为 850bp、450bp大小的 2条带), 使用XbaⅠ进行酶切可以区分出XX型 (1 .3kb), Xx型 (1. 3kb、910bp、390bp), xx型 (910bp、390bp) 3种基因型。ER基因     

实时定量PCR分析健康人外周血线粒体DNA 4 977 bp缺失

目的：用实时定量PCR方法分析健康人外周血线粒体DNA4 977 bp的缺失情况。方法：收集27例年龄在17～44岁的健康人外周血,用荧光实时定量PCR方法对每个样品同时检测线粒体DNA 4 977 bp缺失的量和无4 977 bp缺失的量,进行定量分析。结果：在27例健康人外周血样品中,线粒体DNA4 977 bp缺失的阳性率为70.37%（19/27）;19例有线粒体DNA4 977 bp缺失的样品,其扩增产物的CT值在第35个循环到第39个循环之间;无线粒体DNA 4 977 bp缺失的扩增产物的CT值在第15个循环到第21个循环之间;不同年龄组间线粒体DNA 4 977 bp缺失和无线粒体DNA4 977 bp缺失的量均无统计学差异。结论：本文中超过2/3的健康人外周血含有线粒体DNA 4 977 bp的缺失;在有该缺失的样品中大约每10^6～10^7拷贝中携带有一个线粒体DNA4 977 bp缺失;随年龄的增长外周血中线粒体DNA 4 977 bp的缺失未显示出累积现象。